[发明专利]利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法

权利要求书

1.利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，按特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：鳞茎膨大培养基MS+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+5％蔗糖(pH 5.8)，配制液体培养基体积为反应器罐体体积的1/2-3/5。

(2)反应器灭菌和预运行：加入培养基后，对反应器罐体和管道系统进行蒸汽灭菌，灭菌后将反应器调节到25±1℃、调节过滤空气进气量，同时调节反应器空气出口阀使反应器主体内液体培养基处于拟均匀流动的循环流状态，湍动区流速2-3cm/s，保持罐内压力恒定大于0.02Mpa，运行2天，验证灭菌效果并确保反应器运行稳定。

(3)培养籽球的准备：在无菌环境中，将常规组培脱毒籽球芽切去叶片和部分基部组织，纵切成2-3块直径3.0-5.0mm籽球块，按2500-3000籽球块/升的数量准备培养材料。

(4)培养籽球的接种：使用70％酒精对反应器借种口进行灭菌，点燃反应器借种口的火圈对反应器接种口灭菌用，然后在接种火圈点燃状态下，迅速打开接种口盖将籽球转移进反应器内，然后将接种口盖拧紧。

(5)反应器运行条件：将反应器调节到22±1℃；光照强度1500-2000Lx，光照12h/d；调节过滤空气进气量，同时调节反应器空气出口阀使反应器内液体培养基处于拟均匀流动的循环流状态，湍动区流速3-5cm/s，保持反应器内压力恒定在0.03-0.05Mpa。

(6)反应器运行过程中补料：每2-3天观察反应器内培养液水分损耗，用蠕动泵通过补液孔向反应器添加灭菌蒸馏水，保证培养液体积。观察培养籽球生长状态，培养40-45d，培养籽球直径可达1.0-1.4cm，根系在3-5条/粒，籽球重0.7-1.2g/粒。

(7)冷藏：取出步骤(6)培养的组培鳞茎用清水洗去培养液，包裹于消毒草炭中，经4-6℃冷藏处理45天打破休眠(4℃冷藏处理时间可在2-4个月之间)

(8)移栽驯化：将步骤(7)鳞茎，选择具夏季冷凉气候的800-1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上定植。

2.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于生物反应器中用于百合组培脱毒籽球培养的液体培养基成分为：MS+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+5％蔗糖(pH5.8)；

3.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于借种于液体培养基中的籽球块量为2500-3000籽球块/升；

4.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于培养籽球块在反应器中培养的条件为：22±1℃；光照强度1500-2000Lx，光照12h/d；液体培养基湍动区流速3-5cm/s为拟均匀循环流状，反应器内压力恒定在0.03-0.05Mpa，培养40-45天。

5.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于反应器中培养籽球鳞茎直径达1.0-1.4cm，根系在7-10条/粒，籽球重0.7-1.2g/粒时为冷藏、定植标准。