[发明专利]一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法。

背景技术

多糖是醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，其结构多样且分布广泛，是自然界含量最丰富的物质之一，也是与人类生活紧密相关的一类生物高分子。多糖是一类非特异性免疫增强化合物，能提高机体的免疫功能，增强抗病能力，具有抗衰老、防癌、抗癌以及防治肝炎等作用，受到人们的普遍关注。

绞股蓝又名七叶胆、甘茶蔓、七叶参等，是葫芦科绞股蓝属植物，始载于《救荒本草》，性寒、味甘，归肺、脾、肾经，具有清热解毒、补气生津、祛痰止咳、安神固精等功效。绞股蓝含有丰富的皂苷、糖类、黄酮类、多种维生素、氨基酸、矿物质及甜叶素等。多糖是绞股蓝主要的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节功能、降低血糖血脂等方面的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，以提高绞股蓝多糖的生物活性。

为了实现以上目的，本发明绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，取绞股蓝多糖，按照87.5ml/g的量加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF），超声波处理20分钟，在加入体积比为1：8的氯磺酸和吡啶，在90℃条件下反应2小时，经分离纯化、透析干燥得到硫酸化绞股蓝多糖。

所述分离纯化步骤为：将反应后的硫酸化多糖溶液置入冷水中，用氢氧化钠溶液中和至pH为7.5，加入乙醇并静置24小时，离心收集沉淀。

所述乙醇加入量为加入前总溶液体积的3倍。

本发明采用氯磺酸与吡啶对绞股蓝多糖进行硫酸化修饰，并对方法中氯磺酸与吡啶的配比、反应时间、反应温度进行了优化，易于操作，而且在反应前采用DMF对绞股蓝多糖进行分散处理，提高了绞股蓝多糖硫酸化的酯化收率。修饰后的绞股蓝多糖具有很高的生物活性，能够显著提高动物机体的免疫能力，也能够显著的对抗地塞米松对动物机体引起的免疫抑制，效果显著。

具体实施方式

实施例

本发明的硫酸化绞股蓝多糖的具体制备方法如下：

1、绞股蓝多糖的提取：取绞股蓝1kg烘干，粉碎，加乙醇回流提取两次，每次1h，药渣加入10倍量水，武火煮沸后文火煮2h，滤出药渣，再加水煎煮2次，合并滤液，减压浓缩，离心去除沉淀，上清缓慢加，hhhh加加乙醇至80%，搅匀后静置过夜，离心取沉淀，用乙醇、丙酮洗涤，干燥即得粗绞股蓝多糖58.4g。

2、粗绞股蓝多糖的纯化：

⑴ 去除果胶及色素 将绞股蓝多糖用蒸镏水配成10%的溶液，缓慢加入无水氯化钙至2%，室温搅拌2h，然后离心去除果胶酸钙沉淀。上清液加H₂O₂使其终浓度为5%，NaOH溶液调节pH至8.5-9.0，室温搅拌5h，离心，弃去沉淀，上清加入3倍乙醇，4℃过液，离心后沉淀用乙醇、丙酮依次洗涤，干燥得精制绞股蓝多糖。

⑵柱层析 湿法装Sepharose Fast Flow柱，用0.9%NaCl冲洗，过夜。取精制绞股蓝多糖0.5g溶于100ml蒸镏水，微孔滤膜过滤后上样，分别用蒸镏水、0.15mol/L的NaCl水溶液洗脱，收集多糖部分，真空浓缩，再过Sephadex G-200色谱柱，0.15mol/LNaCl洗脱，收集多糖部分，真空浓缩，再经Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥，即得纯化的绞股蓝多糖。（在洗脱过程中流速控制在1ml/min，每10ml收集1管，每隔4管用苯酚-硫酸法测定多糖含量，绘制洗脱曲线，合并含糖管的洗脱液，再浓缩处理。）

3、绞股蓝多糖的硫酸化修饰

绞股蓝多糖采用氯磺酸和吡啶进行硫酸化修饰（酯化处理），以修饰的反应温度、氯磺酸与吡啶的体积比、反应时间为考察因素，以产物量和硫酸基取代度为指标，按L₉(3⁴)正交试验配制9种酯化试剂（表1）。反应结束后反应产物用硫酸钡比浊法测定硫酸基取代度。

表1 正交试验设计因素水平表