[发明专利]一种用于扩增HSV-1碱性核酸酶基因的试剂盒和表达HSV-1碱性核酸酶的方法

权利要求书

1.一种用于扩增单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12的试剂盒，包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对和其他相关试剂。

2.根据权利要求1所述的用于扩增单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12的试剂盒，其特征在于：还包含T载体。

3.根据权利要求2所述的用于扩增单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12的试剂盒，其特征在于：所述T载体为pMD19-T载体。

4.一种表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)扩增目的基因：提取单纯疱疹病毒I型病毒基因组作为模板，以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-1的UL12基因片段，扩增程序为：96℃预变性3min，95℃变性40s，68℃～72℃退火延伸2min30s，31个循环，72℃延伸10min；胶回收扩增的UL12基因片段；

(2)构建重组质粒：将获得的UL12基因片段与表达质粒连接，获得重组表达质粒；

(3)诱导表达：将步骤(2)获得的重组表达质粒转化大肠杆菌；培养含有重组表达质粒的大肠杆菌使其复制至处于对数期；加入异丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶诱导表达；离心收集菌体；

(4)变性：破碎步骤(3)获得的菌体，离心收集沉淀，用包含变性剂的洗涤液洗涤沉淀，获得蛋白溶液；

(5)复性：用复性液复性步骤(4)获得的蛋白溶液，获得活性蛋白。

5.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于：步骤(1)所述扩增目的基因的方法为：提取单纯疱疹病毒I型病毒基因组作为模板，以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-1的UL12基因片段，扩增程序为：96℃预变性3min，95℃变性40s，68℃～72℃退火延伸2min30s，31个循环，72℃延伸10min；胶回收扩增的UL12基因片段；将扩增得到的UL12基因片段与T载体连接形成重组T载体，再以该重组T载体为模板，以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列作为引物进一步扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的UL12目的基因片段，扩增条件不变。

6.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于：所述退火、延伸温度均为68℃。

7.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于：步骤(2)中表达质粒为pET系列质粒。

8.根据权利要求9所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于：所述表达质粒为pET32a-UL12或者pET28a-UL12质粒。

9.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于：步骤(3)中大肠杆菌为E.coli BL12菌株，或者为E.coli Rosetta菌株。

10.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于：步骤(4)中变性采用的方法为：

用洗涤液A两次洗涤步骤(3)获得的菌体；冷冻超声破碎菌体，离心收集沉淀；用洗涤液B、C、D依次洗涤、离心、收集沉淀；用洗涤液E洗涤沉淀，获得蛋白溶液；

所述的洗涤液A：包含50mM Tris-HCl[pH8.0]、2mM EDTA、100mMNaCl的溶液；

洗涤液B：包含50mM Tris-HCl[pH8.0]、2mM EDTA、100mM NaCl、1％NP40的溶液；

洗涤液C：包含50mM Tris-HCl[pH8.0]、2mM EDTA、100mM NaCl、3％TritonX-100、1mM苯甲基磺酰氟的溶液；

洗涤液D：包含50mM Tris-HCl[pH8.0]、2mM EDTA、100mM NaCl、0.5％TritonX-100、1.5M盐酸胍、1mM苯甲基磺酰氟的溶液；

洗涤液E：包含100mM Tris-HCl[pH8.0]、2mM EDTA、100mM NaCl、10mMβ-巯基乙醇、1mM苯甲基磺酰氟和4～6M盐酸胍的溶液。