[发明专利]表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞及制备方法

权利要求书

1.表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞，其特征在于：由骨髓间充质干细胞[lineage^-/CD117(c-kit)⁺]经体外诱导分化而来，转染了可表达CCR5基因的逆转录病毒质粒，用于治疗多发性硬化症。

2.根据权利要求1所述的表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞，其特征在于所述的骨髓充质干细胞来源于成年小鼠骨髓，表达Nestin与SOX2。

3.根据权利要求1所述的表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞，其特征在于所述的转染了可表达CCR5基因的逆转录病毒质粒为转染了可表达CCR5、由CMV启动的逆转录病毒质粒，作为基因治疗的良好载体，携带并有效表达外源基因CCR5。

4.根据权利要求1所述的表达趋化因子受体CCR5的骨髓源神经干细胞的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

步骤一、小鼠骨髓源神经干细胞的生成与鉴定

提取4-6周龄C57BL/6小鼠全骨髓细胞，用微珠标记抗体及磁性细胞分选仪(Miltenyi Biotec)筛选出间充质干细胞[lineage-/CD117(c-kit)+]，体外用bFGF和EGF诱导分化为神经干细胞；经免疫组化染色、荧光显微镜检测，证实为Nestin与SOX2阳性表达，可鉴定为未分化神经干细胞；

步骤二、构建CCR5和EGFP共表达的质粒、转染骨髓源神经干细胞及CCR5表达的检测；

克隆小鼠CCR5基因、构建共表达CCR5和EGFP的逆转录病毒质粒，由CMV启动子驱动；以293T细胞包装病毒；用病毒上清转染BM-NSCs；对照组转染只表达EGFP的逆转录病毒质粒；以免疫组化法和流式细胞仪检测CCR5的表达，证实被转染的BM-NSCs可有效表达CCR5和GFP；

步骤三、CCR5转基因骨髓源神经干细胞的趋化性实验

微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的；滤膜将小室分隔成上下两部分，BM-NSCs在上面，趋化因子RANTES在下面，并通过滤膜形成一定浓度梯度；BM-NSCs则沿着梯度穿过膜孔，粘附在膜的下面，迁移5h后取出滤膜染色，并计数滤膜下表面的细胞数。