[发明专利]一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒及其应用。

背景技术

腺病毒是一种没有包膜的直径为70～90 nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9 nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100 bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55×10³Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状结构。上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有47种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群（subgroup）。而Ⅴ型腺病毒是目前最常用的腺病毒，具有广泛的应用前景。腺病毒可以感染并且在HEK293细胞中复制，而5型腺病毒表达一种特殊的外壳蛋白Hexon，感染腺病毒的HEK293细胞使用甲醇固定后，再用抗Hexon的一抗孵育，一抗会与腺病毒上的Hexon蛋白结合，此时加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，待二抗与一抗结合后再加入辣根过氧化物酶的底物DAB进行染色，然后洗脱多余的染色液，被病毒感染的阳性细胞会被染成褐色，计数阳性细胞，利用公式计算病毒滴度。而其测定方法目前仅限于TCID50法，该检测方法耗时长，可重复性低，为精确测定带来极大挑战。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种测定Ⅴ型腺病毒滴度的酶联免疫法。

本发明的目的之二在于提供该酶联免疫法的操作方法。

本发明的目的之三在于提供该酶联免疫法的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒，其特征在于该该试剂盒测定Ⅴ型腺病毒滴度采用了酶联免疫法。

一种制备根据权利要求1所述的用于测定Ⅴ型腺病毒滴度的酶联免疫法，其特征在于该方法的具体步骤为：

(1)选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5×10⁵个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、5%CO₂培养1小时。

(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100μl病毒样品。

(3) 37℃、5% CO₂感染2天。

(4)轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml，-20℃孵育20min。

(5)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

(6)使用1%BSA的PBS室温封闭1小时。

(7)加入0.25ml的1×anti-Hexon抗体溶液至每个孔中，室温孵育1小时。

(8)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

(9)加入0.25ml1×辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，室温孵育1小时。

(10)使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

(11)加入0.25ml新配置的1×DAB工作液至每孔，室温孵育10min。

(12)弃DAB，使用PBS冲洗2次，每孔加入1mlPBS。

(13)每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。

(14)计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度，公式如下：

根据权利要求1所述的Ⅴ型腺病毒滴度检测的试剂盒在测定Ⅴ型腺病毒滴度中的应用。

本发明设计对测定Ⅴ型腺病毒滴度采用了酶联免疫法，并应用人胚胎肾细胞HEK293为模型研究其对Ⅴ型腺病毒滴度检测的精确性。为酶联免疫法在Ⅴ型腺病毒滴度检测应用提供了一种新手段。

       具体实施方式：

HEK293细胞的培养：人胚胎肾细胞HEK293细胞系培养于37℃，5%CO₂恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混匀细胞；用移液器将其移入15ml离心管中，1500rpm离心3min；去上清；用5ml无菌1×PBS将细胞悬起，并吹打混匀；加约7ml细胞悬液于装有1ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养，约2天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。