[发明专利]一种抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎是小鸭的一种高度致死性的病毒性传染病，本病最先在美国发现，其后在英国、加拿大、德国等许多养鸭国家陆续发现本病。本病的特征是发病急，传播快，死亡率高，临诊表现角弓反张，病例变化为肝炎和出血。本病唱给养鸭场造成重大的经济损失。目前虽然已经有一些抗鸭病毒性肝炎的药品或制剂，但不能从根本上预防鸭病毒性肝炎。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，以抑制鸭病毒性肝炎病毒，保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎的感染，达到从根本上预防的目的。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法，将鸭病毒性肝炎接种与鸡胚尿囊腔中进行增殖，从中提取病毒抗原；然后将提取的病毒抗原在健康猪机体上进行免疫，再从免疫猪的脾脏上提取得到抗鸭病毒性肝炎转移因子。

本发明的制备方法具体步骤如下：

1）鸭肝炎病毒抗原的制备：将鸭病毒性肝炎接种于9日龄-10日龄的鸡胚尿囊腔中进行增殖，33-37℃，培养72-96h，取鸡胚尿囊液，装入经灭菌消毒的离心管中内，超声波处理后离心，弃去沉淀取上清，得到粗病毒抗原；

2）病毒抗原的提取：在离心管中依次小心铺设20%-66%不同浓度梯度的蔗糖溶液，然后在溶液液面上加粗抗原，粗抗原的加入量为每个梯度蔗糖溶液体积的20%，经离心处理，小心吸出在蔗糖梯度层中出现的病毒带，透析除去蔗糖得到病毒抗原；

3）病毒抗原免疫猪：挑选健康免疫猪，用上述提取的病毒抗原进行皮下多点注射免疫，免疫至少4次，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后，取脾脏冷冻保存待用；

4）从免疫猪的脾脏中提取抗鸭病毒性肝炎转移因子：

将免疫猪的脾脏除去表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗，然后将脾脏剪碎，加入2倍-4倍体积的生理盐水，在低于10℃的条件下用高速组织捣碎机捣碎制得猪脾脏匀浆液；

将猪脾脏匀浆液进行超声波处理，在-60℃-80℃快速冷冻，水浴30℃-37℃融化，交替冻融4～6次，每次融化后都用组织匀浆高速匀浆粉碎；然后加入2倍体积的冰冻生理盐水，离心取上层血红色的液体，再用砂心漏斗过滤，取滤液；

将滤液用盐酸调pH值至5.0-6.0，上清液先用0.2μm中空纤维柱过滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液，将所得的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，即得到抗鸭病毒性肝炎转移因子。

步骤2）所述蔗糖溶液分为4个递增的蔗糖浓度梯度，分别为20-25%，30-45%，40-55%，60-66%。 

步骤3）所述取免疫猪脾脏之前，取免疫猪静脉血，用ELISA方法或者免疫荧光方法检测静脉血的病毒特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，再取免疫猪脾脏。

转移因子是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽—核苷酸复合物，它能够将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给正常受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高机体的细胞免疫功能，抵抗真菌、病毒、细菌等的感染；同时促进B淋巴细胞的转移因子分泌作用，能够诱导细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的免疫功能，被誉为T细胞活性的触发剂。转移因子分子量小、无毒、无抗原性、不起过敏反应，不产生对抗转移因子且可超越种系界限应用的优点。

本发明采用鸭病毒性肝炎病毒提取特异性转移因子，该转移因子能够有效的抑制鸭病毒性肝炎病毒，能够保护正常机体细胞免受鸭病毒性肝炎病毒的感染，从根本上预防鸭病毒性肝炎的发生。另外，本发明的制备方法简单易行，生产时间短，成本低，具有很好的应用前景。

具体实施方式

实施例1

本实施例采用鸭1型病毒性肝炎为例，制备抗鸭病毒性肝炎转移因子，该方法的步骤如下：

1）鸭肝炎病毒抗原的制备：将鸭1型病毒性肝炎接种于9日龄的鸡胚尿囊腔中进行增殖，33℃，培养72h，取鸡胚尿囊液，装入经灭菌消毒的离心管中内，用超声波超声10min（50Hz），5000rpm/min离心20min，弃去沉淀取上清，得到粗病毒抗原；

2）病毒抗原的提取：在离心管中依次小心铺设20%、30%、40%、66% 4个梯度的蔗糖溶液，每一个梯度蔗糖溶液为1ml，最后在溶液液面上加粗抗原0.2ml，经40000r/min离心2.5h，在第二层有一病毒带，小心吸出，透析去蔗糖得到病毒抗原；