[发明专利]重组载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及重组载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜及其应用。 

背景技术

机体损伤修复的机制是必须先有微血管的生成，随后形成新生的肉芽组织，然后才能输入所需的各种细胞和营养成分，促进损伤组织的修复。血管新生是一个复杂的、有步骤、有序的过程，不仅需要刺激因素的激发，诸多细胞的参与，还需要各种细胞因子、生长因子的参与以及细胞外基质的协作。Ang-1、VEGF、FGF、PDGF对伤口肉芽组织形成、血管增生和胶原纤维合成有重要作用。 

VEGF是由两个相同亚基以二硫键交联结合成的二聚体糖蛋白，分子量40-45KD，其基因位于染色体6p21.3，全长14kb，由8个外显子和7个内含子组成，由于其mRNA的剪接方式不同，形成多种存在形式，其中VEGF121和VEGF165为分泌性可溶性蛋白，可通过与邻近的血管内皮受体结合，发挥促进血管内皮细胞增殖、迁移和增加血管通透性的作用。血管新生中，VEGF及其受体被认为是作用最强、特异性最高的关键调控因子。VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外可促进内皮细胞的生长，在体内可以诱导血管发生。 

近年来，在血管新生过程中Ang-1及受体Tie2对新生血管的形成、重塑、成熟等的重要调节作用正逐渐受到关注。Ang-1和VEGF在血管的再生中二者协同发挥作用，VEGF作用于血管形成的早期，可促进原始血管网的形成，而Ang则作用于随后的血管改建、塑形，促进形成成熟且有空间结构的血管网，因而VEGF和Ang-1双基因共表达的基因治疗有可能是促进血管新生的创新探索。 

目前，双基因共表达载体的构建策略主要有：1.基因之间以IRES (internal ribosome entry site)(内部核糖体进入位点)序列连接；2.双启动子表达载体；3.剪切载体；4.基因之间以Furin的切割靶点序列连接；5.基因之间以2A序列连接；6.表达融合基因。 

基因之间以IRES(internal ribosome entry site)(内部核糖体进入位点)序列连接，该IRES序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一个转录本上翻译出不同的蛋白；基因之间插入polyA-promotor(CMV)双启动子表达盒构建双基因共表达载体，带有polyA-promotor(CMV)各自独立启动子的两个表达盒构建于一个载体上，双基因各自独立转录出两种不同的mRNA，并各自独立翻译出不同的蛋白。 

本领域技术人员公知：腺病毒载体是一类很有应用前景的基因治疗病毒载体，腺病毒是一种双链DNA病毒，腺病毒载体与其他载体相比有如下许多优点：1.宿主范围广，对人致病性低；2.具有感染率高、对分裂和非分裂细胞都能感染；3.能携带很长的治疗基因和同时表达多个基因；4.不整合到染色体中，无插入致突变性，安全性好；5.能有效进行增殖，滴度高，易加工制备等。采用pAdEasy腺病毒表达系统具有明显优点：1.腺病毒质粒的同源重组可在大肠杆菌BJ5183中高效进行，且细菌繁殖快，同源重组能力强，因而从根本上克服细胞内同源重组率低的缺陷；2.腺病毒中可插入11kb的基因片段或同时插入多个基因片段；3.由于在腺病毒骨架中含有的GFP报告基因，非常便于监测病毒包装成功与否、检测病毒滴度及感染效率等。所有这些都避免了病毒的空斑克隆纯化过程，大大减少了病毒的制备时间。 

构建双基因共表达重组转移载体是作为肿瘤的基因治疗药物的有效途径之一，但到目前为止，国内外没有关于利用IRES策略构建VEGF和Ang-1双基因载体的报道；另外，利用构建polyA+promoter双启动子策略构建双基因重组转移载体，虽然理论有相关研究，实践中却并没有相关报道，而且该方法存在以下难点：在利用在构建polyA+promoter双启动子策略构建双基因重组转移载体的过程中，发现polyA中有pacI酶切位点，无法采用pacI酶切线性化后在293A细 胞中进行腺病毒包装，影响双基因的正常表达。 

丝素蛋白膜作为一种新型医用生物材料，具有无毒性、无刺激性、透湿性好等许多优异性能，可以用作伤口敷料，也可用作组织修复的支架材料，甚至可以开发成人工皮肤。而如何使支架材料充足血管化，进一步开发和制备血管诱生丝素蛋白基支架材料联合MSC的小口径人工血管仍未见进展。 

发明内容

本发明的一个目的是提供基因表达效率高，血管诱导能力强的VEGF165及Ang-1的重组载体。