[发明专利]一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法

权利要求书

1.一种应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：

（1）在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3:1～1.5:1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM的碱作为流动相；

（2）取元胡的乙醇粗提物用固定相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制成样品溶液；

（3）取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，薄层层析跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集；

（4）将步骤（3）中收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品R_f值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。

2.如权利要求1所述的应用pH-区带精制逆流色谱分离去氢紫堇碱的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：

（1）在分液漏斗中分别加入氯仿、甲醇、水以体积比为1.5～3:1～1.5:1组成的溶剂体系，充分振摇后静置分层，取上相加入终浓度为10～20mM的无机酸作为固定相，下相加入终浓度为10～20mM的碱作为流动相；

（2）取元胡的乙醇粗提物用固定相和未碱化的下相溶解，所述的固定相加入量为25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，所述的未碱化的下相加入量为0～50ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制成样品溶液；

（3）取固定相注满逆流色谱仪的分离柱，随后注入样品溶液，待进样完成后，开启速度控制器，使分离柱正转，在750～850r/min转速下，以1.5～2.5ml/min的流速持续注入流动相，以波长190～400nm的紫外检测器检测，用自动部分收集器收集洗脱液，TLC跟踪检测至洗脱液中无去氢紫堇碱组分，停止收集； 

（4）将步骤（3）中收集得到的洗脱液通过薄层层析和高效液相进行检测，合并与去氢紫堇碱标准品R_f值及保留时间相同且去氢紫堇碱纯度大于90%的洗脱液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到去氢紫堇碱。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的元胡的乙醇粗提物按如下方法制得：取元胡药材粉碎，用60～98%乙醇回流提取1～5次，合并各次的提取液，抽滤后滤液减压浓缩至浸膏状，用酸溶液捏溶至捏溶液的pH值为2～3，静置10~30小时，取上清液过滤除去沉淀；滤液用氯仿萃取1~5次，收集合并氯仿层，合并的氯仿层用质量浓度为1～3%氢氧化钠溶液萃取，取氯仿层旋转蒸发回收氯仿，得元胡的乙醇粗提物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的酸溶液为质量浓度为1～2%的盐酸水溶液或1～2%的硫酸水溶液。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述样品溶液的进样的体积小于分离柱柱体积的30%。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中所述的溶剂体系中氯仿、甲醇和水的体积比为2:1:1。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述的无机酸为盐酸。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述的碱为三乙胺。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述注入样品溶液可以通过进样圈注入样品溶液或通过泵泵入样品溶液。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤（4）所述的高效液相色谱的检测条件为：YMC ODS C₁₈ column (4.6×250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠水溶液（32:68，v/v），等度洗脱；流速：0.6ml/min；检测波长：345nm；进样量：20μl。