[发明专利]使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法

权利要求书

1.用于在酵母二倍体细胞中合成包含至少两个不同亚基多肽链的分泌型异聚多亚基蛋白的方法，该方法包括：用第一种表达载体转化第一种酵母单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第一种亚基且其可操作连接第一种酵母启动子；用第二种表达载体转化第二种酵母单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第二种亚基且其可操作连接第二种酵母启动子；由所述第一种和第二种酵母单倍体细胞生成二倍体细胞；在所述第一种和第二种亚基表达且以所述多亚基蛋白的形式分泌的条件下培养所述二倍体细胞。

2.依照权利要求1的方法，其中所述酵母二倍体细胞是毕赤氏酵母属的物种。

3.依照权利要求2的方法，其中所述毕赤氏酵母属的物种选自下组：巴斯德毕赤氏酵母、Pichia methanolica、和Pichia angusta。

4.依照权利要求1的方法，其中所述异聚多亚基蛋白是包含至少重链和轻链的可变区的抗体。

5.依照权利要求4的方法，其中所述异聚多亚基蛋白是包含至少重链和轻链的可变区和恒定区的抗体。

6.依照权利要求4的方法，其中所述第一种表达载体包含轻链或重链序列的文库，且所述第二种表达载体包含单一轻链或重链序列。

7.依照权利要求4的方法，其中所述第一种表达载体包含轻链或重链序列的文库，且所述第二种表达载体包含轻链或重链序列的文库。

8.依照权利要求1的方法，其中所述第一种和第二种酵母单倍体细胞是互补营养缺陷型。

9.依照权利要求8的方法，其中由所述第一种和第二种酵母单倍体细胞生成二倍体细胞的所述步骤包括所述单倍体细胞的交配。

10.依照权利要求9的方法，其中由所述第一种和第二种酵母单倍体细胞生成二倍体细胞的所述步骤包括所述第一种和第二种单倍体细胞的原生质球融合。

11.依照权利要求1的方法，还包括在生成所述二倍体细胞前校准所述第一种或第二种亚基的表达水平的步骤。

12.依照权利要求1的方法，其中所述第一种酵母启动子和所述第二种酵母启动子是相同的。

13.依照权利要求1的方法，其中所述第一种酵母启动子和所述第二种酵母启动子是不同的。

14.依照权利要求1的方法，其中所述两种酵母启动子或其一是组成型启动子。

15.依照权利要求1的方法，其中所述两种酵母启动子或其一是诱导型启动子。

16.依照权利要求1的方法，其中所述启动子是GAP启动子。

17.依照权利要求1的方法，其中至少一种所述不同亚基多肽链包含为二倍体分泌和表达优化的信号序列。

18.依照权利要求1的方法，其中所述培养步骤是在基本培养基中进行的。

19.依照权利要求18的方法，其中所述基本培养基缺乏选择剂。

20.依照权利要求1的方法，其中所述培养步骤是在低温进行的。

21.依照权利要求1的方法，其中所述多亚基蛋白由所述二倍体细胞分泌达到至少约100mg/升培养基的浓度。