[发明专利]使用同心双锥面镜实现全内反射荧光显微的系统与方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用同心双锥面镜实现全内反射荧光显微的系统及方法，可广泛适用于生物学、医学，生物物理以及材料化学等领域的研究。

背景技术

荧光探针是指在吸收特定波长的光后，可以把吸收光转换为不同波长的光发射出来的一类物质的统称。使用不同的荧光探针可以标记样品内部不同的位置，从而可以用来探测样品的微观结构，还可以实时观察荧光标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应。荧光显微技术已经成为化学和生物样品成像的有力工具。

困扰荧光显微技术的一个主要问题是样品离焦部分的荧光信号带来的背景干扰。如何消除背景噪声，提高显微图像的信噪比和分辨率是荧光显微技术领域的研究热点。激光共聚焦荧光显微术和全内反射荧光显微术是目前最常用的两种技术方案。

激光共聚焦荧光显微利用高度聚焦的激光束对样品逐点扫描成像，荧光信号经过探测针孔滤波后被光电倍增管探测收集，通过计算机软件可以重新组合生成一个三维图像。激光共聚焦荧光显微具有三维成像能力而且还具有很好的空间分辨率，但是由于它采用点扫描成像方式，所以它的成像速度并不快而且也容易对样品产生光损伤。

全内反射(又称全反射)是指当光线从光密介质进入到光疏介质，入射角大于临界角时，因为没有折射而都是反射，故称之为全内反射。从几何光学的角度来看，当发生全反射时，光线会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，这部分光场就是所谓的衰逝波。衰逝波平行于界面传播，垂直于界面强度指数衰减。衰逝场强度E_z可表示为：

Ez=E0e-z/dp.]]>

其中定义为衰逝场的穿透深度。

E₀是界面处的电场强度，λ是真空中的光波长，n₁是光密媒质的折射率，n₂是光疏媒质的折射率。

衰逝场的穿透深度非常小，通常只有200nm左右。

细胞内的很多重要的生命活动过程均存在于细胞表面。全内反射荧光显微利用全内反射产生的衰逝波激发样品，激发区域被限定在样品表面的一薄层范围内(200nm)，不受到来自样品内深层区域信号的干扰，因此具有极高的信噪比和对比度，近年来已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。另外，全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像而使用CCD相机，在一个时间点获得一幅完整的二维图像，大大提高了成像速度，减少了样品光损伤，从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。

全内反射荧光显微成像根据其成像系统的不同可分为棱镜型和物镜型两种。棱镜型系统在实现上比较简单，也不容易受到入射光信号的干扰，激光经棱镜耦合照射在样品与载玻片的界面处(棱镜与载玻片之间配以折射率匹配的浸没油)，精确调整入射角使发生全反射，荧光信号由样品的另一面进入显微物镜并被CCD探测。棱镜型系统的缺点是样品的位置受到棱镜的限制，并且激发出的荧光要通过整个样品才能被探测到，降低了成像的对比度。

物镜型系统中样品的放置则非常方便，显微镜的物镜既作为收集样品荧光信号的接收器，同时又作为发生全内反射的光学器件。且可与多种其它技术相结合，例如激光微加工，光镊技术等，因此展现出更加诱人的应用前景。由于细胞的典型折射率约为1.35，根据snell定律，要想实现全内反射，显微物镜的数值孔径NA必须大于1.35，因此当我们使用为NA＝1.4的物镜时，只有很小的一部分物镜孔径范围(1.4-1.35＝0.05)可以被利用。在实验中，为了保证均匀的照明，激光束通常被调制成为很细的光环进入显微物镜后瞳。如图1所示，通常使用一个圆形挡光板挡住平行光束的中间部分，显然，挡光板挡住了大部分照明光，所以整个系统的透过率很低(小于5％)，导致照明亮度不够。