[发明专利]一种猪细菌的多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种猪细菌的多重PCR检测方法，通过以下技术方案实现：

(1)被检标本DNA提取：取病变组织匀浆后37℃培养，再经蛋白酶K温浴消化，取消化后的培养物离心、收集沉淀，用ddH₂O重悬后再离心一次，弃上清，沉淀用等体积的2×TZ和ddH₂O重悬，-20℃静置，经沸水浴后立即置冰浴中冷却，4℃下离心，取上清使用或者-20℃冻存备用；

(2)设置PCR检测试剂盒：由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液组成；

(3)PCR扩增：在PCR试剂管中加入Taq DNA聚合酶及处理后的标本DNA，同时设阴性、阳性对照，微量移液器吹打混匀后瞬时高速离心，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件为95℃预变性4min，94℃变性1min，60.5℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸8min，保存于4℃；

(4)扩增产物分析：将PCR产物进行琼脂糖电泳，被检标本孔出现的电泳条带与阳性对照和阴性对照比对，以判定标本为猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌的阳性或阴性。

2.根据权利要求1所述的一种猪细菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中2×TZ配制方法为：Triton-100：4ml，NaN₃(5mg/ml)：500mg，Tris(1M)：12.114g，加蒸馏水定容至100ml，加热溶解。

3.根据权利要求1所述的一种猪细菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR试剂管含10×PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、6条引物，6条引物是分别按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段，用ddH₂O稀释至20uM备用：

S1：5′-GCTCATCGCGTTAATGGTCTT-3′

S2：5′-CAAAAGTAGCAAGTAACCCTCCCG-3′

A1：5′-GGTGGAGAAGATGGTTGAG-3′

A2：5′-CAATGACGGACAACTTTCG-3′

P1：5′-CTGCTCTATCCGCTATTTACC-3′

P2：5′-AGTCCCACCACATCAAATCC-3′

4.根据权利要求1所述的一种猪细菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，所述阴性对照为高压灭菌的双重蒸馏水。

5.权利要求1所述的一种猪细菌的多重PCR检测方法在猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌3种细菌单个或多个混合感染的样品检测中的应用。