[发明专利]基于标准抗原的花生过敏原蛋白Arah2的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属食品检测技术领域，特别涉及过敏原蛋白的检测技术。

背景技术

酶联免疫吸附检测（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种酶免疫方法，20世纪90年代末期ELISA技术发展迅速，加以全自动酶标分析仪的应用，使ELISA的特异性和灵敏度有了很大的提高，在食品检测领域中的应用大大扩展。ELISA的特点是抗原或抗体的固相化和酶标记，在目前最常用的ELISA中，抗体要结合在固相载体的表面与样品蛋白（抗原）自由反应。抗体和抗原反应后用另外一种用酶标记的抗体（二抗）来检测已经反应结合在固相载体表面的样品蛋白（抗原）。结合在固相载体表面的抗体一定时，与之结合的样品蛋白（抗原）越多，酶标记的抗体的颜色反应就越强，同时血清抗体的浓度越高，ELISA显色也越强。为了能够检测痕量的食品过敏原ELISA中使用了生物素标记的二抗和含有过氧化物酶的链霉亲和素。

在食品安全方面ELISA技术已广泛应用于兽药残留、农药残留、疫病、有害微生物、动植物毒素等的快速检测分析， 并取得了较好的效果。随着人们对食品过敏认识的深入和重视程度的加强，现在发展了多种ELISA方法用于食品过敏原的定性或定量检测分析。ELISA已经成为一种系列化、微量化、商品化的食品安全快速检测方法，是目前应用最广泛的生物检测技术之一。已经实施过敏原法规标准的欧盟、美国、加拿大和日本等国家也均推荐ELISA法为过敏原的快速检测方法。

目前过敏原检测所用的试剂盒中，多采用分离纯化的过敏原蛋白作为抗原制备抗体，并用作标准品，对待检样品中的过敏原蛋白进行定性或定量检测。因食物过敏原为(糖)蛋白，这类(糖)蛋白有些稳定，有些不稳定，这就使试验的敏感性受到限制。即使过敏原足够稳定，其来源和分离纯化途径的不同也会导致该蛋白质的差异以至影响相应特异性抗体的质量，最终导致检测试剂无法标准化。 

发明内容：

本发明的目的在于建立一种基于标准化抗原的花生过敏原蛋白Ara h2 ELISA检测方法。实现该蛋白的高灵敏性、高特异性检测，提高定量结果稳定性和重复性，使得不同批次样品定量结果可比。

本发明所述的基于标准抗原的花生过敏原蛋白Ara h2的ELISA检测方法，主要包括下列步骤：

1、标准抗原的DNA序列获取

提取花生总RNA。

采用RT-PCP技术，将编码花生Ara h2蛋白的RNA反转录，获得与之对应的双链DNA并进行扩增。

2、标准抗原，即重组花生Ara h2蛋白的表达与纯化

将上一步骤获得的DNA序列连接到适当的载体上。

将连接产物转化到感受态细胞中。

诱导目标基因在细胞中表达。

分离纯化目标蛋白，并进行纯度和浓度鉴定。

3、重组蛋白多克隆抗体的制备

切胶回收电泳纯过敏原蛋白并乳化。

免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。

分离抗血清并进行效价测定。

4、基于标准抗原的竞争抑制ELISA体系建立

确定包被抗原和抗血清的稀释度

竞争抑制ELISA标准曲线的建立

本发明采用重组花生过敏原蛋白Ara h2作为标准抗原，制备标准抗体，并在此基础上建立基于标准化抗原的花生过敏原蛋白Ara h2 ELISA检测方法。重组食物过敏原可大量生产且具有高纯度、品质稳定等优点，替代天然提取物用于过敏原ELISA检测，灵敏性更高、特异性更强，可实现定性和定量检测试剂的标准化。

附图说明

图1为RT-PCR产物电泳结果。

图2为重组质粒菌落PCR鉴定结果。

图3为重组质粒酶切鉴定结果。

图4为表达产物的SDS-PAGE检测。

具体实施方式：

本发明将通过以下实施例进一步说明，但本发明并不受其限制。

对花生Ara h2基因序列进行分析，确定RT-PCR引物，并交由上海生工公司合成。称取2克花生种子，加入液氮研磨成粉，采用改进的Trizol法提取花生总RNA。获得总RNA后，利用紫外分光光度计测量其在260nm，280nm 处的紫外吸光值（A），并计算A260/A280 的比值，确定其纯度。RNA样品经紫外检测，A260=1.159，产率为211.93ug.g-1，A260/ A280=1.90 表明无蛋白质或酚污染。