[发明专利]血吸虫童虫体外共培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及日本血吸虫人工转化童虫与其终宿主细胞的体外新培养方法的建立。

背景技术

血吸虫在终宿主体内的肺期童虫阶段，被视作宿主免疫系统攻击的最佳靶标，其抗原可诱导Th1介导的保护性免疫反应。故肺期童虫的特异性靶分子被认为是血吸虫病新一代疫苗的最佳候选分子，其筛选对血吸虫病疫苗的研制极为重要。然而，肺期童虫的材料来源较为困难，从感染的终宿主体内获取的百分率仅为30％，从而影响大量靶抗原的提取与对其特性的了解。目前国内外研究需要用到日本血吸虫童虫时常用体外常规培养方法(周述龙，林建银，蒋明森。血吸虫学。北京：科学出版社，2001。)——即以“841”培养基中培养的血吸虫童虫替代。然而，研究显示(Chai M，McManus DP，McInnes R，et al.Cell Mol.Life Sci.，2006，63(7-8)：919-929)，体外常规培养方法培养的日本血吸虫童虫，尽管在超微结构上与终宿主体内童虫相差不大，但在基因表达上存在显著差别。由此认为，体外常规培养方法培养的日本血吸虫童虫替代宿主体内童虫进行分子生物学与免疫学等研究时尚需谨慎。为此，建立一种新的更接近于宿主体内环境的日本血吸虫童虫体外培养方法成为当前血吸虫培养研究的重点方向之一。

宿主的环境因子会影响血吸虫的生长、发育与基因表达(Chai M，McManus DP，McInnes R，et al.Cell Mol.Life Sci.，2006，63(7-8)：919-929；Gobert GN，Chai M and McManus DP.Parasitol.，2006，17：1-8)。本发明将机械断尾的日本血吸虫童虫与其终宿主细胞共培养，以期获得模拟宿主体内日本血吸虫正常生长发育的共培养条件，试图减少体外培养的日本血吸虫童虫与宿主体内虫体在基因表达上存在的显著差异，为血吸虫分子生物学与血吸虫病免疫学等研究提供更接近于宿主体内童虫的材料。发明人比较了共培养3天童虫与宿主体内发育3天的肺期童虫、体外常规培养3天童虫之间在形态学、基因表达以及可溶性蛋白表达等方面的差异。结果显示，共培养童虫的各指标更接近于宿主体内肺期童虫。本发明所建立的共培养方法兼顾了童虫生长发育所需的营养成分以及宿主因子对其生长发育影响这两方面的因素，避免了常规体外培养方法缺乏宿主因子作用的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血吸虫童虫体外培养的共培养方法，该培养方法中的共培养童虫的各指标更接近于宿主体内肺期童虫。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

血吸虫童虫体外培养的共培养方法，该共培养方法是将血吸虫童虫与其终宿主细胞共培养。

其中，所述血吸虫童虫为人工转化童虫，具体为血吸虫尾蚴经人工脱去其尾部后转化的童虫。

其中，所述血吸虫为寄生人体的各种血吸虫，本发明实施方案中为日本血吸虫。

其中，所述血吸虫童虫可以是转基因童虫。

其中，所述终宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如来自人、鼠等，在本发明实施方案中将血吸虫童虫与人肝静脉内皮细胞、人肺腺癌细胞以及鼠成纤维细胞等进行了共培养。

其中，所述培养的方法是用终宿主培养基重悬血吸虫童虫，将其接种至经传代培养20～30小时密度为1.0×10⁵～3.0×10⁵个/ml的宿主细胞上，调整虫体密度为400～500条/ml，于37℃、5％CO₂的条件下培养，所述培养基优选为含有10％新生小牛血清的高糖DMEM，附加常量抗生素，pH7.2～7.4。

在本发明的实施例中，用含10％新生小牛血清的高糖DMEM(小牛血清与培养基均为Gibco，Grand lsland，New York产品)附加常量抗生素(终浓度青霉素为100IU/ml、链霉素为100μg/ml)先以最佳密度传代人肝静脉内皮细胞(ED25)、人肺腺癌细胞(H1299)、鼠成纤维细胞(3T3)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，培养基的pH值为7.2～7.4。传代20～30小时后，将机械断尾人工转化的日本血吸虫童虫以400-500条/ml的密度分别加入各宿主细胞中共培养3天。

本发明共培养方法具有如下优点：

1、共培养童虫的体长均比常规培养童虫的长，体宽均比常规培养童虫的窄，长宽比值均比常规培养童虫的大，三项指标均与宿主体内童虫的更接近。

2、共培养童虫的外形、体表结构与体被结构比常规培养童虫的更加类似于宿主体内获得的童虫。