[发明专利]用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种境检测技术领域的基因工程试剂盒及其应用方法，具体是一种用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用。 

背景技术

环境雌激素类污染物(Environmental Estrogens，EEs)是自然或人类活动中产生的在环境中持久存在的一类化学物质，可通过直接或间接的方式在动物和人类体内蓄积、富集，在机体内与激素受体结合，它的作用与动物内分泌激素的作用类似，会引起人类及多种生物的神经系统失调、内分泌紊乱、免疫能力下降以及生殖失常等，直接关系着人类社会与生物圈生存与繁衍的根本性安全。因此，必须对EEs作全方位的检测，以评估其潜在的风险与危害。 

目前，EEs的检测手段主要有化学法和生物学法。化学法中应用最广泛的一种是高效液相色谱法，它往往与其它技术相结合来检测EEs，如固相微萃取技术-高效液相色谱法(SPME-HPLC)，高效液相色谱法-飞行时间质谱法(HPLC-ToF)以及高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)等。虽然化学法测定环境激素含量准确性较高且方法较多，但其样品前处理和测定步骤十分复杂，仪器价格昂贵，且只能局限于对目标化合物的分析方面，限制了化学法在检测EEs的推广与应用。生物检测方法可以兼顾EEs之间的加和作用和协同作用。子宫生长试验是最早建立的生物学检测EEs活性的方法，随后，细胞检测EEs的方法如人类乳腺癌细胞培养，大鼠子宫腺癌细胞培养，肝细胞卵黄素生成实验等也有一定应用。尽管动物及细胞检测方法可比较有效地研究雌激素类物质的代谢过程，但其模型建立难度大，操作复杂，筛选通量不大，且哺乳动物细胞的抗毒素能力较低，所以不太适于大量样品的EEs快速检测。相比于哺乳动物细胞，微生物具有培养操作简单，筛选通量大，抗毒素能力强等特点，更适于高通量样品的快速筛查。利用分子生物学技术建立的重组酵母系统(YES)(Takamura Enya T，Ishihara J，Tahara S，et al.Analysis of estrogenic activity of food stuffs and cigarette smoke condensates using a yeast estrogen screening method.Food Chem Toxicol，2003，41(4)：543～550)是近年来应用较广泛的EEs生物检测方法，其检测灵敏度和特异性较好，且费用低廉。但酵母生长速度较慢，检测周期较长，仍需进一步完善。随着我国经济的快速发展和EEs污染 问题的日益严重，亟需建立更为简便快捷、高效灵敏且经济的高通量生物学检测EEs的方法。 

与其它微生物相比，大肠杆菌具有生长周期短，遗传背景清楚，操作步骤简单，改造技术成熟，培养成本低廉等优势，是进行环境EEs生物学检测的极佳个体，结合近年来分子生物学研究的热点之一——蛋白质内含肽(Intein)，可实现高效灵敏、快捷经济的高通量检测。蛋白质内含肽是存在于前体蛋白质中的一段氨基酸序列，在蛋白成熟过程中可发生自我剪切，从前体蛋白中释放出来，同时连接两端的肽链，形成有活性的成熟蛋白。目前，蛋白内含肽已应用到蛋白质工程领域的各个方面，如蛋白快速纯化，蛋白互作检测，蛋白体内外连接及环化，及蛋白质结构与活性关系研究；在医学、制药、传染病学、农学等多个领域都有应用。由于蛋白质内含肽最早是在微生物中发现，且具有微生物易培养、易于操作、理化性质明确等性质，因此内含肽在微生物分子生物学方面的应用最为广泛。最近，有关条件性蛋白内含肽的研究备受研究者关注，一些条件性蛋白内含肽被陆续构建成功。这些内含肽仅在特定条件下，如温度和药物诱导时(Rubing Liang et al.A novel strategy to create temperature-sensitive mutants with T7-expression system in Escherichia coli，J Microbiol Meth，2007，68(3)：497～506)，才能发生剪切，产生有活性的目标蛋白。利用条件性蛋白内含肽来调控蛋白活性的方法与其它方法相比，其本底表达更低，不同条件下蛋白的表达水平与活性差异更明显，使用范围更广泛。若利用雌激素敏感的蛋白内含肽，将该内含肽与颜色蛋白融合，即可实现受雌激素诱导的颜色蛋白表达，从而在分光光度计下进行快速检测。