[发明专利]一种显微受精方法

权利要求书

1.一种显微受精方法，其特征在于，包括步骤：

1)取新鲜精液或冻融后的精液；

2)取注射HCG后14～18小时的新鲜卵母细胞；

3)将步骤1)所述的新鲜精液中的精子和冻融后的精液中的活精子分别注射到步骤2)所述的卵母细胞中，得注射卵；

4)用5umol/L离子霉素+2mmol/L6-二甲基氨基嘌呤激活注射卵，获得受精卵；

5)将受精卵放入TCM199+10％FBS+1.25mM酮酸钠+0.1mM EDTA培养液中培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的冻融后的精液通过下述方法制备：取出装有要解冻精液的细管置于42℃水浴中20秒，即获得冻融后的精液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，冻融后的精液放于38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的新鲜精液的处理还包括：将新鲜精液用D-PBS液离心洗涤后加入D-PBS液，放于38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中取注射HCG后14小时的新鲜卵母细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中用显微注射针将精子注射入卵母细胞中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，应用注射针前用前端细长的水银塑料吸管吸取1～2ul水银，把水银吸管前端细长的部分从注射针的后端伸入进注射针，在离注射针末段1.0～1.5cm的位置缓慢吹出吸管内的水银，使水银柱在针管中长度在2～3mm之间，水银灌好后，把注射针连接到Piezo操作臂上。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，注射时第一极体在12点钟位置，从3点钟的位置进针，设置强度和频率参数为2×2或3×2。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)还包括：注射后6-8h检查原核和第二极体，当出现2原核2极体时判定为受精；当出现1原核1极体、1原核2极体、2原核1极体时判定为活化。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述培养液的配方为：18mlTCM199中加入2mlFBS、0.00275g丙酮酸钠、0.00075gEDTA、0.0015g青霉素、0.001g链霉素，混匀，调pH为7.3。