[发明专利]花鱼骨微卫星位点及引物

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及花鱼骨微卫星位点及引物。

背景技术

花鱼骨(Hemibarbus maculates)，隶属鲤科、鮈亚科、鱼骨鱼属，广泛分布于我国江河湖泊中，是天然水体中一种常见的中小型野生经济鱼类。但过去的十几年中，由于过度捕捞、筑坝挖沙以及水体污染，花鱼骨的野生资源已被严重的破坏。为了满足市场的需求，已经对花鱼骨进行了大规模的人工养殖，但目前的苗种没有经过人工选育，存在着生长速率低、抗病性差等现象，因此，获得优良的养殖品种已经成为我国花鱼骨养殖产业健康、可持续发展急待解决的重要课题之一。

家系选育是获得优良品种的重要手段之一，家系选育过程中，保持完整、准确的系谱信息才可以有效指导亲本选留，从而避免近交衰退现象。在良种培育中，为了实现家系遗传参数的准确评估，需要早期对选育品系进行标记。而采用物理标记对幼体进行标识存在较大的局限性，如标记存续时间短，成本高、工作量大，幼体达到标记大小才能标记，无法完全消除环境误差等问题。因此，选用有效的分子标记，进行高通量的亲子鉴定和家系管理已成为花鱼骨养殖业亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供花鱼骨微卫星位点及多态性引物，即提供10个花鱼骨的微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为花鱼骨的遗传选育提供可用于种群、家系鉴定的分子标记，以弥补现有技术的不足。

本发明通过磁珠杂交法从花鱼骨基因组DNA中筛选出10个微卫星位点，其核苷酸序列分别是SEQ ID NO：1-10。

微卫星序列还包括在严格条件下与上述的核苷酸序列杂交的，包含相同微卫星重复单位的核苷酸序列分子。

本发明的微卫星引物是从序列SEQ ID NO：1-10的微卫星重复的侧翼序列上设计的正向、反向引物。

微卫星引物序列分别为SEQ ID NO：11-30。

微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表1：

表1：10个微卫星位点及对应引物信息

本发明的微卫星多态性引物用于花鱼骨种群遗传多样性检测，包括如下步骤：

1)基因组DNA的提取：采用酚抽提法提取花鱼骨基因组DNA；

2)微卫星PCR扩增：用FMM、HEX和TMR荧光标记的微卫星引物扩增花鱼骨基因

组DNA；获得花鱼骨个体微卫星扩增产物；

3)扩增产物电泳：在MBI3100自动测序仪上检测，用ROX500作为分子量内标，个体微卫星扩增产物用软件GeneMMpper 3.2来分析分子量大小；

4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，利用GENEPOP Version 3.4计算遗传多样性参数；

上述的微卫星引物选自序列分别为SEQ ID NO：11-30的微卫星引物。

本发明从花鱼骨基因组DNA中筛选出10个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获引物的扩增结果具有高的多态性和稳定性，可用于花鱼骨的种群遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种领域。

具体实施方式

一、微卫星位点的筛选

1、基因组DNA提取、酶切及回收：

用酚抽提法提取花鱼骨基因组DNA：每个个体称取100mg肌肉，用无菌水清洗两次后，剪碎后加入10mM Tris-Hcl pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，10mM NaCl，1％SDS，100μg/mlproteinase K的裂解液600μl，在55℃消化肌肉后，12000rpm离心10min，取上清到新的1.5ml离心管中，加入比例为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇并抽提两次，比例为24∶1氯仿和异戊醇抽提一次后，水相转移到新管中加入-20℃的无水乙醇，12，000rpm离心10min，75％乙醇清洗沉淀两次，室温下晾干，溶于100μl 0.1×TE中。

2、酶切、回收及接头连接：

取100μg基因组DNA，用限制性内切酶SAu 3aI部分酶切，使酶切片段大部分在250～750bp，有机抽提法终止反应，无水乙醇沉淀回收，溶于200Ml 0.1×TE中。将酶切的片段同Brown接头(5’GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC3’)连接，16℃连接过夜，在65℃10min终止反应，并再次切胶回收。

3、微卫星序列分离和PCR扩增：