[发明专利]一种显微受精胚胎体外发育用培养液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养液，尤其涉及一种显微受精胚胎体外发育用培养液。

背景技术

显微受精被广泛地应用于基础的生殖研究和人的辅助生殖技术中来治疗不孕症。从历史上讲，在哺乳动物，显微受精最早开始于金黄地鼠；自此之后，显微受精对于哺乳动物受精机制的研究提供了无价的信息。

由于动物基因工程和生殖技术的进步，现在，显微受精技术已经被广泛的使用，来鉴别特定基因在生物学上的意义或证实在体外通过实验操作后的配子其基因的正常形态。

在显微操作中，培养液是影响体外胚胎的发育的重要因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种显微受精胚胎体外发育用培养液，其主要包含：TCM199、FBS、丙酮酸钠、EDTA、青霉素、链霉素。

所述培养液的各成分的比例为：18mlTCM199∶2mlFBS∶0.00275g丙酮酸钠∶0.00075gEDTA∶0.0015g青霉素∶0.001g链霉素。

所述培养液的pH为7.3。

本发明还提供所述的培养液的制备方法，其主要包含步骤：TCM199中加入FBS、丙酮酸钠、EDTA、青霉素、链霉素，混匀。具体地，所述培养液的各成分的比例为：18mlTCM199∶2mlFBS∶0.00275g丙酮酸钠∶0.00075gEDTA∶0.0015g青霉素∶0.001g链霉素。所述培养液的pH为7.3。

本发明提供的培养液，其制备方法简单，生产成本低，适合于胚胎的体外发育培养。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。

具体实施方式

实施例1精子的准备

取兔(6～8月龄新西兰兔，SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK<沪>2004-0005)精液用D-PBS液(商购)2000r/min离心洗涤三次然后缓慢的加入D-PBS液，放在38.5℃、5％CO₂、100％湿度下的培养箱中缓慢上游10分钟。

实施例2卵母细胞的准备

供体母兔为6-8月龄、体重3kg左右的初产新西兰兔，按Kennelly和Foote(1965)的方法，即连续3天每天2次(间隔12h)每次皮下注射FSH50IU/只(宁波第二激素厂生产)，最后一次注射FSH后12h，耳缘静脉注射HCG(宁波第二激素厂生产)100IU/只并与结扎公兔交配，HCG注射后14、16、18h进行取卵，在无菌条件下剪下输卵管，吸取10ml的冲卵液，由喇叭口向宫管结合部方向冲卵，每侧用5mL冲卵液，将卵丘卵母细胞复合体放在装有含0.2％透明质酸酶的D-PBS液的Eppendorf管中，在涡旋混合器上震荡消化5min去除颗粒细胞，在体视显微镜下捡出经酶消化的卵母细胞，用培养液洗涤三次，然后放入38.5℃、5％CO₂、100％湿度下平衡12h以上的培养液微滴中，直到显微注射。

实施例3将精子注射到卵母细胞中

注射前，用捡卵针把5-10枚卵母细胞移入操作液滴中，然后用注射针抓取一个精子放入聚乙烯吡咯酮(PVP)液滴中，用针尖在精子尾部迅速划过进行制动，看到尾部打折即可，随后从尾部吸入注射针内。注射时第一极体在12点钟位置，从3点钟的位置进针，设置强度和频率参数为2×2或3×2，激发1至2个脉冲击穿透明带，继续进针同时将精子小心的推至针尖处，直至针尖插入卵母细胞深处，几乎贴近对侧质膜时，调换参数到1×1的档，用Piezo弱脉冲击穿卵母细胞质膜，将精子吐出，回吸注入卵内多余的液体，轻轻退针，完成一次注射。依次操作，每次注射从开始制动到注射完毕在2min内完成，所有显微操作在室温下完成。

将注射后的卵母细胞用本领域常规的机械刺激方法激活。

受精卵和孤雌活化卵的判定标准：注射后6-8h检查原核和第二极体形成情况，只有当出现2原核2极体(2PN、2PB)时判定为受精；当出现1原核1极体(1PN、1PB)、1原核2极体(1PN、2PB)、2原核1极体(2PN、1PB)时判定为活化。

实施例4受精卵的培养