[发明专利]一种专性烃氧化菌检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用微生物检测方法技术领域，特别是涉及一种为地表微生物勘探技术提供微生物检测手段的专性烃氧化菌检测方法。

背景技术

微生物油气勘探是基于地下油气藏的挥发性或半挥发性烃的垂直迁移理论逐步建立起来的。伴随着表层土壤中一定浓度的烃持续供给，氧化层中的以烃作为唯一碳源的微生物得以快速生长和繁殖，其丰度差异就可以用来间接表征土壤中轻烃浓度的高低。因此，这种以烃为唯一碳源的氧化微生物(即：专性烃氧化菌)数量的测定对于油气勘探的科研和生产实际工作具有十分重要的指导作用和现实意义。但由于这种烃氧化微生物测试难度极大，其复杂的生理学特性导致先前很多研究的特异性和准确性很难得到保证，严重限制了微生物油气勘探的发展。

前苏联Kartsev等(1959)采用了一种最简单的方法来测定土壤中的烃消耗细菌。把土壤放入培养反应器，随后注入一定量的无机盐培养溶液并在顶空加入一定比例的丙烷或丁烷气体。培养一段时间后，根据培养基表面的菌膜厚度来估算细菌的数量和活性。这种方法虽然在早期取得了一些效果，但由于其受主观判断的影响较大，培养时间较长，误探率也较高，逐渐被淘汰。

另一种是气体利用检测法，其原理是测定培养过程中被烃氧化细菌消耗烃的量。Taggart等(U.S.Patent NO.2349472)构建了一系列较复杂的气体分压测试装置，监测培养时间内挥发性烃分压的变化，间接表征了土壤中的烃氧化细菌数量。这种方法的缺点在于培养时间特别长，通常需要数周时间。另外环境中很多微生物具有烃降解能力，在长期的驯化后，或多或少会表现出一定的烃消耗活性。

为了克服以上缺点，Hitzman等(U.S.Patent NO.2880142)采用了平板计数法或滚管法来直接测定土壤中的烃氧化微生物。他在培养基中加入高浓度毒性物质为唯一碳源来培养烃氧化菌，而这些毒性物质(如醇，醛等)可以抑制其他土壤微生物的生长。但是这种方法的缺点也是周期长，而且一般都是通过计数平板上的菌落数。琼脂本身也是一种碳源，不可避免地会造成假阳性，带来计数误差。

除此以外，也有研究者(U.S.Patent NO.2269889)通过测定烃氧化过程中的代谢产物来表征烃氧化菌群数量。烃代谢过程中产生的羧酸经过氧化物后会产生颜色变化，同时氧化还原电位也会发生变化。但季节变化和土壤中钙镁金属离子都会对最终结果造成较大影响。

由此可见，现有的传统测试技术和测试手段远不能满足实际生产的要求。非特异性、假阳性、培养时间过长、实验操作和设备的复杂性等都大大限制了专性烃氧化微生物计数的实际应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种专性烃氧化菌检测技术，能够快速准确地测定气态烃氧化菌数量。该技术需要满足3个条件：(1)特异性地检测烃氧化菌或其代谢中间产物；(2)大幅度缩短计数周期以适应规模化的油气勘探；(3)用液体培养基替代琼脂平板。

本发明通过如下技术方案来实现上述目的：

本发明的专性烃氧化菌检测方法，包括如下步骤：

(一)基础培养基的制备

(二)专性烃氧化菌培养管的制备

(三)专性烃氧化菌检测。

所述的专性烃氧化菌检测方法是将待测样品逐级稀释后，加入到已经注入基础培养基的专性烃氧化菌培养管进行培养，直至测试管中无菌生长为止，然后根据稀释菌液接种培养后的阳性试管数，用统计学方法计算出初始土样中的烃氧化菌数量。

其中：

所述的(一)基础培养基由基础无机盐，微量元素以及生长促进剂依次用蒸馏水溶解，充分混匀，pH值调整至7.2-7.4，即配置成基础培养基。

在具体实施中，

按照基础培养基中浓度(g/L)计，所述的基础无机盐可以包括下列组分：

KNO₃             1

MgSO₄·7H₂O      0.2

KH₂PO₄           0.2

K₂HPO₄           0.8

NaCl    1。