[发明专利]9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱、其制法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物药物领域，具体涉及9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)及其制备方法，本发明还公开了其抗心血管疾病的用途。

背景技术

心血管疾病是一常见病，随着社会人口的老龄化，发病率日益上升，因此心血管药物一直是国内外研究的活跃领域。四氢异喹啉类生物碱广泛分布于各种植物中，具有广泛的生物活性，特别是在心血管方面具有显著的活性。如四氢小檗碱和四氢巴马汀具有明显的抗心律失常和钙拮抗作用，但水溶性差，影响了其药效的发挥。为了增加水溶性，同时保持其活性，对它们进行了结构修饰，化学合成了大量的衍生物，其中不乏有活性好的化合物发现。但有关四氢小檗碱类化合物的糖基化修饰并未见报道。

微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物转化具有高度的立体结构选择性，能专一地催化特定的反应、无需繁琐的保护与脱保护操作，具有高效、环保的优点，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。若在含有羟基的四氢小檗碱类化合物中引入糖基可以在一定程度上解决生物利用度差的问题，同时保持其活性。

发明内容

本发明公开了结构式I的化合物：

命名为9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(简称NAD-G)。本发明同时也包括结构式I的化合物的溶剂化物，化合物I的¹³C-NMR数据见表1：

表1四氢小檗红碱(NAD)与9-O-β-D-葡萄糖基四氢小檗红碱(NAD-G)¹³C-NMR数据如下：

药理试验证明，本发明的式I化合物具有优异的抗心血管疾病效果，其溶剂化物具有同样的药理功效。

本发明的式I化合物优选用生物转化方法以四氢小檗红碱为底物进行转化制备，方法如下：

为了寻找适宜转化四氢小檗红碱成9-O-β-D-葡萄糖基化四氢小檗红碱(NAD-G)的菌种，发明人筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL1086菌种对鲁斯可具有较强的转化能力(见表2)。

筛选所用液体培养基(PDA)：200克新鲜去皮马铃薯加沸水500ml煮15min后过滤，滤液加葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄0.75g、Vb₁10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加Na0H或HCl调pH值至6.0，150ml三角烧瓶每瓶分装30ml液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。

筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5％的琼脂，15ml具塞试管每管5ml，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。

菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，参见：Nair，M.S.R.，andBasile，D.V.Bioconversion of artenium B to artmisinn.天然产物杂志(Jounal of NaturalProducts)1993，56(9)：1559。先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5％(V/V)，同条件培养24h后加样。

样品的制备及加样：四氢小檗红碱溶于乙醇，配成10mg/ml溶液备用；每瓶经两步活化的菌液(30ml)加0.5ml样品溶液，使每瓶菌液含四氢小檗红碱5mg。同条件培养120h后，中止反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏和并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。

空白对照：空白对照设阳性对照(底物+培养基)、阴性对照(培养基+菌)、溶剂对照(培养基+菌+乙醇)，培养和萃取条件同上。

转化产物的薄层鉴定：

薄层条件：

薄层板：0.7％的CMC-Na制成的硅胶G板。

展开剂：正己烷∶氯仿∶甲醇(5∶3∶1)上行法展开。

显色剂：碘化铋钾。

操作：

转化萃取物和空白对照萃取物分别点于薄层板，充分展开后取出自然晾干，喷以碘化铋钾显色。转化结果见表2。

表2微生物转化四氢小檗红碱筛选结果