[发明专利]赖氨酸脱羧酶抗原表位、抗赖氨酸脱羧酶抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，涉及一种赖氨酸脱羧酶抗原表位、抗赖氨酸脱羧酶抗体。本发明还涉及分别含有所述抗原表位或抗体的组合物、以及所述抗体在检测赖氨酸脱羧酶中的用途。

背景技术

赖氨酸脱羧酶(英文名称为lysine decarboxylase，酶分类号EC：EC4.1.1.18)，据cDNA序列推译的水稻赖氨酸脱羧酶蛋白(putative lysine decarboxylase-like protein，Pldclp)基因位于水稻基因组的第4条染色体上，由Os04g0518800基因编码，其cDNA全长为1109bp，其中参与编码赖氨酸脱羧酶氨基酸的碱基有750bp，编码250个氨基酸残基，分子量为27493.85Da。赖氨酸脱羧酶家族具有保守结构域PGGxGTxxE。Shoshi Kikuchi等(Science 301，376(2003))最早克隆测序了籼稻日本种群的cDNA，在据cDNA推译的氨基酸序列中发现有赖氨酸脱羧酶家族的保守结构域，从而推测此基因可能是赖氨酸脱羧酶家族成员之一。

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，也是植物生长发育、逆境反应等基础研究的模式植物，因为相对于其它禾本科植物，它的基因组相对较小(430Mb)。水稻基因组测序成果极大地推动了水稻相关研究的进展，带动了水稻转录组学的研究，也推动了蛋白质组学的研究，利用2DE-MASS技术对水稻发育、逆境、愈伤组织分化等进行蛋白质组学分析，鉴定了一系列的差异表达蛋白质，同时，随着水稻功能基因组学工作的开展，对水稻蛋白质功能的验证和比较研究也日益增加，蛋白质印迹(Western blotting，WB)技术因具有灵敏度高、特异性好、操作简便、结果直观等优点而被广泛应用于检测水稻蛋白质在不同组织中的表达水平。随着水稻基因组计划的完成，蛋白质研究已成为后基因组研究的重要任务。抗体是研究蛋白质必不可少的工具之一，在一种新的cDNA被克隆以后，由此推译出的氨基酸序列人工合成多肽并与载体偶联，免疫制备其抗体，是一种快速而有效的手段。

水稻赖氨酸脱羧酶蛋白主要定位于质膜上，在植物的耐寒、解毒等抗逆生理中发挥作用。赖氨酸脱羧酶的主要生物学功能是催化L-赖氨酸脱羧生成尸胺(1，5-戊二胺)，尸胺有刺激性气味，它是生物体内广泛存在的具有生理活性的含氮碱，在腐烂的尸体和精液中都可分离得到。尸胺可以作为第二信使调控植物衰老进程、促进雌雄蕊的发育，外源施用尸胺可以改善坐果和促进果实发育，在增加果实产量和研究植物生长中有重要利用价值。赖氨酸脱羧酶在大肠杆菌中有大量的研究，并且在大肠杆菌体内发现多种赖氨酸脱羧酶，但在水稻中的作用研究较少，在水稻中的具体生理功能还不清楚。

然而，迄今为止，水稻赖氨酸脱羧酶仍属于高度有待鉴定的蛋白，该蛋白在转录水平上的活动是其存在的证据。并且在现有技术中，通常制备的多克隆抗体特异性不高，用于检测目标物质会存在准确性不足的问题。另一方面，如果用赖氨酸脱羧酶制备抗原的话，如果是用化学合成的方法，全长的氨基酸序列有1996个氨基酸，蛋白质空间结构的重建是一个很困难的工作，再现与生物体内相同的空间构象仍然是现阶段蛋白质学研究的难点。一般来说抗原表位合成简易，准确性高，成本低廉，空间构象容易再现，因此有必要开发一种具有代表赖氨酸脱羧酶本身的抗原表位(antigenic determinant，AD)(又称抗原决定簇，是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团)来代替全长蛋白。

尽管目前已经有用于预测抗原表位的软件，例如BEPITOPE软件，但是预测得到的抗原表位中会有30％左右的非有效抗原表位，即不能特异性地代表抗原的抗原表位，或者不能引发免疫应答(Chang HT，Liu CH，Pai TW.Estimation and extraction of B-cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches.J Mol Recognit.2008 Nov-Dec；21(6)：431-41)。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人在通过BEPITOPE软件预测得到多个抗原表位序列的基础上，进行了大量的实验和不懈的努力，结果发现在预测的24个抗原表位中有一个抗原表位序列SSQGKKKSYQDAA(SEQID NO：3)是最有效的抗原表位，并且其具有良好的抗原特异性，并且制备了能与该蛋白酶特异免疫结合的抗体，该抗体具有足够的灵敏性和准确性。由此提供了下述发明：