[发明专利]一种水产品中主要过敏原的快速免疫磁珠层析方法

说明书

技术领域

本发明涉及食物过敏原的检测方法，特别是涉及一种检测水产品中主要过敏原的免疫磁珠层析方法，该方法主要是使用甲壳类和贝类的主要过敏原原肌球蛋白（Tropomyosin，简称Tm）、鱼类主要过敏原小清蛋白（Parvalbumin，简称Pa）的免疫磁珠层析检测方法。

背景技术

食物过敏是由食物引起的机体对免疫系统的异常反应，近几十年来，世界范围内食物过敏反应症患者呈现逐年上升趋势，据WHO报道，到2010年，全球可能有40％到50％的人患有过敏症，食物过敏现已成为一个新兴的食品安全问题。食物过敏原为食物中引发或激起过敏反应的物质，通常是在特定食物中含有的含量丰富、天然存在的蛋白质。根据过敏原反应的速度、机制及临床特点将致敏机制分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型，其中大部分食物过敏是由IgE介导的I型超敏反应，一般症状包括呕吐、腹痛、腹泻等，也包括皮肤反应及呼吸道症状，严重情况下甚至会出现过敏性休克或死亡，目前尚无有效的治疗方法。为了保护易感者健康，部分国家和地区对食物过敏原的标签标注进行了严格规定并列入了立法范围。

鱼类和甲壳类水产品及其制品是联合国粮农组织公认的两类易引起食物过敏的主要致敏食物。据调查，在我国15～24岁年龄段人群中，约6％的人有过食物过敏的经历，在我国青少年过敏人群中对鱼类等海产品过敏的约占3-6％，位居其它致敏食物的首位。水产品的主要过敏原可分为两大类，一为贝类及虾蟹等甲壳类动物中的原肌球蛋白（Tropomyosin），另外一种则是鳕鱼等鱼类中的小清蛋白（Parvalbumin）。由于食物成分的复杂性，加之食品加工过程中使用各种配料和添加剂，传统的化学分析很难满足食物过敏原的检测要求，因此，食物过敏原的快速检测技术研究一直是国内外科学家的研究热点。

目前，食物过敏原的检测技术以分析全蛋白或酶解后肽段氨基酸序列的质谱技术、检测编码过敏原DNA片段的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术及分析过敏原性的免疫学检测技术为代表。

质谱技术能精确测定全蛋白或酶解后肽段的氨基酸序列，再根据相应数据库来确定致敏蛋白，但是质谱技术存在着费时、所用仪器昂贵、检测费用相对较高等缺点。

PCR方法则在检测过程中易因操作不当受到污染而产生假阳性结果，存在操作要求技术性强、不能反映食物的真正过敏性即人们摄入该食物后会产生过敏反应等缺陷。

食物过敏原的免疫学检测技术有酶联免疫吸附法（ELISA）、生物传感器法和免疫层析法。其中ELISA法是目前技术较为成熟的方法，市场上已有杏仁、大豆、花生、甲壳类、芝麻、芥末、羽扇豆、牛奶等食物过敏原的ELISA检测试剂盒，这些试剂盒可在30～60min中内实现定性或半定量检测，但是存在假阳性和假阴性反应。此外，公开号CN101285840A专利申请公开了一种食品中过敏原的固相免疫检测方法，采用可拆式酶标板作为检测载体，利用双抗夹心模式，直接在过敏原特异性单抗上标记酶，再通过底物显色反应来实现检测。该方法检测原理同ELISA法，与双抗夹心ELISA的唯一区别是不需要使用酶标二抗。因此虽然具有多样本同时检测优点，但也存在着假阴性或假阳性反应，检测结果易于受到外界因素的影响（如食品基质，食品的加工程度等）等缺点。

生物传感器法是根据待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信息，再经仪表放大和输出，从而达到分析和检测的目的。目前，微型SPR生物检测器已应用于食品生产过程中花生过敏原的检测，该检测器可实现在线定量检测。但是生物传感器法需要特定的设备和配件，检测成本高，对硬件设施要求极高。食品工业界需要的是快速、简便、高效、特异性强且成本低廉的检测方法，上述这些方法皆无法满足食品工业界的需求。

免疫层析技术是ELISA技术原理的扩展应用，一般使用乳胶颗粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等作为着色标记物。在层析时，标记物与待测物之间形成的复合物可被相应的配体所捕获而聚集于硝化纤维膜上的检测线并呈现出标记物所带有的颜色，因此可以通过纤维膜上显色条的有无、颜色深浅和反射光线等从而实现检测目的，具有操作简便、快速的优点。在目前公开的报道中，大都以胶体金作为指示剂，因此又被称为胶体金检测法。已公开文献中涉及了一种检测水产品食物过敏的免疫胶体金层析方法，可以实现过敏原的定性检测，但是难以进行定量检测，而且目视检测使检测结果不易记录和保存。