[发明专利]一种植物双向启动子BIGDB3

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物双向启动子BIGDB3的克隆与应用。

背景技术

通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的。花椰菜病毒CaMV 35S启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直被人们广泛的使用。然而在转基因过程中由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，这种现象会更严重，从而严重影响了转基因植株的获得和后代的稳定性。而在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因的表达量、表达时间和位置的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，使用35S启动子很难达到这样的要求。这些都是植物基因工程中亟待解决的问题。

对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了多个35S启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为我们利用植物自身的双向启动子进行转基因操作，从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA片段，来源于拟南芥。

本发明提供的DNA片段的核苷酸序列是如下1)或2)或3)：

1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；

3)与所述1)的核苷酸序列具有65％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。

序列表中的序列1由528个脱氧核糖核苷酸组成，是拟南芥基因AT5G67500和AT5G67490的基因间序列。

上述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

本发明的DNA片段(启动子活性片段)还包括与来自序列表中序列1的片段的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的调控片段的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的调控片段的核苷酸序列70％或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地75％或更高，更优选地85％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

含有上述的DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是上述的DNA片段插入载体pMOA34-G/L的多克隆位点制成的重组载体；

上述载体pMOA34-G/L具体可以是将GUS基因和LUC基因分别插入pMOA34载体的多克隆位点得到的载体。

含有上述的DNA片段的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

含有上述的DNA片段的重组菌也属于本发明的保护范围之内。

上述的DNA片段在作为启动子中的应用也属于本发明的保护范围之内。

进一步讲，上述启动子是双向启动子。

上述应用具体可以是上述的DNA片段在驱动目的基因在植物体内表达中的应用。

上述植物为双子叶植物或单子叶植物，如拟南芥或烟草。

实验证明，将本发明的BIGDB1插入载体pMOA34-G/L中的GUS和LUC之间后，BIGDB1能双向启动GUS和LUC，说明BIGDB1具有双向启动功能。

附图说明

图1为pMOA34-G/L-BIGDB3植物双元载体图谱。