[发明专利]高效率转基因棉花表达载体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物表达载体及其应用，特别是高效率转基因棉花表达载体与应用。

背景技术

转基因动物最早的典型例子是1982年由美国华盛顿大学Palmiter等报告的“超级小鼠”。但在这之前，1974年，Jaenisch等用显微注射的方法将SV40的DNA导入到小鼠的胚囊中，在自带小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA，这证明将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。1980年，Gordon等采用受精卵原核显微注射法，首次成功地将疱疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，当时Gordon和Ruddle称这种转化小鼠为“转基因小鼠”。

转基因植物，1983年采用农杆菌介导方法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。现在基因工程已遍及各种动植物及微生物，由于分子生物学技术的飞速发展，转基因对于改良动植物品质、提高抗逆性以及生物医药领域正在发挥巨大的作用。

国内外植物转基因方法：在植物基因转化的研究中已建立了多种转化方法：载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化、基因枪DNA导入转化、花粉管通道法等。目前应用最多、机理研究最明确的为载体转化系统，其载体包括Ti质粒、Ri质粒及病毒转化载体等。花粉管通道转基因方法由我国科学家发明：周光宇在广泛调查国内外远缘杂交工作的基础上，提出DNA片段杂交假说，并设计了外源DNA直接导入受体的花粉管通道法。

通常转基因需要构建高效表达载体，为了使得转基因后的植株容易筛选，一般采用双元表达载体。常用的植物表达载体为pBI121和pCambia系列。筛选标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种选择的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感性，不能生长、发育和分化。在构建载体时，筛选标记基因连接在目的基因一旁，两者各有自己的基因调控序列(如启动子、终止子等)。目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因(产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素)、HPT基因(产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素)和Gent基因(抗庆大霉素)等。常用的抗除草剂基因包括EPSP基因(产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷)、GOX基因(产生草甘膦氧化酶、降解草甘膦)、bar基因(产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或glufosinate)等。其中pCambia1301和pCambia3301较为常用。近几年来，转基因植物中筛选标记基因的生物安全性已引起全球关注。例如，人们担心转基因植物的抗生素抗性标记基因转移进入人或动物的病原菌中，从而引起这些病原菌对抗生素的抗性，使抗生素失去效力。

pCambia3301采用的bar基因作为标记基因，对转基因后代采用喷施Basta(一种除草剂)来筛选可以获得转基因阳性植株。但经过多年研究发现，喷施Basta对于筛选棉花转基因阳性植株准确性不高，同时由于国内许多研究部门采用我国首创的花粉管通道转基因方法，若采用该载体更难以获得令国际同行信服的研究结果。

pCAMBIA1301载体采用超霉素筛选，也不适合棉花转基因。为此我们经过多年研究，构建了pSPT高效植物表达载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物表达载体及其应用。该植物表达载体可以高效率培育转基因棉花。

本发明所提供的植物表达载体，包括表达tfdA基因的表达盒；所述表达盒由依次连接的CaMV35S启动子、tfdA基因和终止子组成；所述tfdA基因的核苷酸序列为序列表中序列2，所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列1。

所述植物表达载体中还包括Flag标签，Flag标签的核苷酸序列为序列表中序列3。

所述植物表达载体的基础构架载体为pCambia1300。

所述植物表达载体按照下述方法构建：

1)将CaMV35S启动子连接于tfdA基因的5′端获得的片段插入到pCambia1300的BstXI和XhoI酶切位点之间，获得重组载体A；

2)将序列表中序列3所述的Flag标签片段插入重组载体A的多克隆位点，获得所述植物表达载体。