[发明专利]一种靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其应用。

背景技术

肝炎，即肝脏炎症，有多种致病因素-如病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物和毒物、酒精等，侵害肝脏，使得肝脏的细胞受到破坏，肝脏的功能受到损害，它可以引起身体的一系列不适症状，以及肝功能指标的异常。肝炎多数情况下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染导致的乙型肝炎，是一种严重威胁全球人类健康的的传染性疾病，也是最严重类型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死于肝硬化和肝癌的风险极高。

HBV属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，全基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。其基因组共有四个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码蛋白包括表面抗原(S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。

据世界卫生组织报道，全世界估计有20亿人感染HBV，其中有3.5亿以上的人为慢性乙肝感染者，估计每年有60万人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，症状可持续数周，包括皮肤和眼睛发黄(黄疸)，尿色深，极度疲劳，恶心，呕吐和腹痛。患者可能需要数月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也会造成慢性肝脏感染，以后可能发展成肝硬化或肝癌。

乙型肝炎病毒通过与受感染者的血液或其他体液(比如，精液和阴道分泌物)接触而在人与人之间传播，传播途径与人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒的传染性比艾滋病毒强50-100倍，乙型肝炎病毒在体外可存活至少7天以上。在此期间，如果病毒进入未感染者的身体，它依然可造成感染。病毒潜伏期平均达90天，但也可能为大约30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可发现，持续时间差别很大。

目前主要是通过婴儿接种乙型肝炎疫苗来预防乙型肝炎的发生，但尽管如此，人群HBV流行率仍然很高。目前主要治疗慢性乙型肝炎的方法仅局限于抑制患者体内病毒基因的表达和复制。如口服核苷类抗病毒药-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的复制，但是停药后复发率高，长期应用则可导致病毒变异，在用药6个月后发生由病毒聚合酶基因发生变异引起的耐药性，使得临床抗病毒治疗面临极大的挑战。

近几年来，随着RNA干扰(RNAi)技术的迅猛发展，为疾病尤其是癌症开辟了全新的治疗途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗方法。该技术通过用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)干扰特定靶基因的表达，来达到治疗疾病的目的，是基因治疗的重要组成部分。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。其作用机制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21-23nt及3’端突出的siRNA，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。

本发明提供了一种用RNAi技术来抗HBV的方法。应用RNA干扰技术，用靶向至HBV基因的siRNA作为靶向药物，在基因的转录后进行干扰，从而有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制，具有特异性强、高效、副作用小、可持续用药的优势，且能弥补目前治疗乙型肝炎药物的不足，在不久的将来可能成为一种新的治疗乙型肝炎的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过siRNA全位点分子库技术筛选出的高效靶向HBV基因的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成：

正义链：5’-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGCNN-3’(SEQ ID NO：3)

反义链：5’-GCAAUUUCCGUCCGAAGGUUUGGNN-3’(SEQ ID NO：4)

其中，N是A、T、C、G或U碱基的任何一种。

换言之，该双链siRNA分子的主干序列为：

正义链：5’-CCAAACCUUCGGACGGAAAUUGC-3’(SEQ ID NO：5)