[发明专利]液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药中间体的分析技术，具体地说是一种液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。

背景技术

N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸是合成抗贫血药叶酸(folic acid)的重要中间体。N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的纯度对于叶酸的质量和医疗效果具有重要的意义。现有技术中没有对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度进行分析的方法，经广泛查阅国内外出版物和检索专利文献，均未见有报道。造成国内外企业为叶酸生产提供原料合成该中间体时，一直无法对其纯度和质量进行分析和监控；造成叶酸质量无法保证，药品的医疗效果无法保证。发明一种方法简便、结果准确、适应性强的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的纯度的方法，对于保证和提高抗贫血药叶酸的质量和医疗效果，是一个十分迫切需要解决的技术问题，也是医药工业的十分重要的任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种方法简便、结果准确、适应性强的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。

本发明技术方案是：

液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，步骤如下：

(1)设定色谱操作条件：

I.取H₃PO₄-KH₂PO₄缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，缓冲溶液/甲醇体积比V_缓冲溶液/V_甲醇＝75/25-85/15；

II.调节缓冲溶液pH：滴加浓磷酸至50mmol/L的KH₂PO₄水溶液中，调节pH＝3.4-4.4；

III.流动相流速为0.2-0.5mL/min；

IV.紫外检测器检测波长：200-310nm；

V.色谱柱：Agilent-Hypersil ODS 100×4.6mm，5um；

VI.Waters 515液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；

VII.进样量：1-20ML；

(2)配制溶液：

I.配制内标液：准确称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；

II.配制标样与样品溶液：

i.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液：准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；

ii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液：

分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL；配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的标准溶液；

分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的标准溶液；

iii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液：准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解，并定容至刻度；

iv.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液：准确移取3.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液，并以流动相定容至10mL；

III.加内标物的混合液的配制：

移取步骤(2)I  配制的内标液0.5mL，加入0.5mL的步骤(2)II配制的各浓度的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液或样品溶液，配制成添加内标物的混合溶液，用于色谱进样使用；

(3)分析方法考察：

I.线性关系考察：以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积比Y＝A_i/A_s对标样的质量浓度C_i作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式；

II.精密度与回收率试验：以标准加入法进行回收率试验，重复进样3-6次，测定结果的精密度；

(4)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品测定：

取步骤(2)II.iv配制的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液注入液相色谱仪中，以步骤(3)所述的内标标准曲线法进行定量测定。

步骤(1)I中流动相甲醇-缓冲溶液体系，体积比V_甲醇/V_缓冲溶液优选为20/80。

步骤(1)II中缓冲溶液的pH值优选为3.7。