[发明专利]一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种人血清、动物血清及其产品、食品以及环境中通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法。

背景技术

戊型肝炎(Hepatitis E)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起，是一种经粪-口传播、以黄疸为主的急性传染病，患病孕妇的病死率更可高达21％。自1955年印度发生第一次大暴发以来，戊型肝炎已在亚洲、非洲与拉丁美洲的很多国家广泛流行。近年来该病亦在日本等发达国家散发流行。我国是戊型肝炎高发的国家，新疆、辽宁、山东等省均有大量流行，极大的危害人类健康。有证据显示，戊型肝炎是一种动物源性疾病，被感染的家养或野生动物可直接传播或通过污染水源传播本病。有研究表明，猪源戊型肝炎病毒可以感染恒河猴和黑猩猩等灵长类动物，而人戊型肝炎病毒在实验条件下也能成功感染猪等动物；血清学调查则发现与猪频繁接触的人群(如饲养员、兽医、屠工)中戊型肝炎病毒的抗体水平明显高于正常人群。日本亦有人因食用了未煮熟的猪肝和鹿肉而引起急性戊肝的报道，提示了猪戊型肝炎病毒在公共卫生和食品安全方面存在的重大意义。

HEV是无包膜的单股正链RNA病毒，其基因组长约7.5kb，有3个开放阅读框。根据HEV各分离株的基因组序列分析，可将其分为4个主要的基因型。I型主要发生于亚非多数国家；II型分离于墨西哥；III型发生于美国和一些欧洲国家；IV型发生于亚洲。其中I型和II型只能感染人，III型和IV型则为人畜共患，可感染人、猪和其它动物。在我国流行的HEV主要为由I型和IV型。但有研究表明，上海地区猪场中已有III型HEV毒株的流行。

迄今为止，对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。这就需要建立一种通用的、高度敏感、特异和快速的检测方法用于HEV的诊断。同时，HEV主要经污染的水源和环境传播，高度敏感的病原检测技术也将有助于分子流行病学调查和病毒溯源。而目前可同时快速鉴定戊型肝炎病毒各个基因型的方法尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，利用TaqMan探针技术建立I、II、III和IV型HEV的多重荧光快速分型检测体系，以期填补技术空白。

为此，本发明采用如下的技术方案：一种不同基因型戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEV ORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TaqMan探针：

所述的扩增引物序列为：

HEV-F    TATTCATCCAACCAACCCCTT，

HEV-R    GTCDCGCCAAGYGGAGC，

该引物为针对不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C。

所述的TaqMan探针序列为：

I-P    CY5-TGTCACCGCTGCGGCCG-BHQ3，

II-P   ROX-AGACGTTGCCGCTGCGTCC-BHQ2，

III-P  HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ1，

IV-P   FAM-CGCATCTGACATWCCARCCGC-BHQ1，

四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列种Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G。

PCR鉴别检测方法的步骤如下：

1)将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30μL DEPC水溶解。

2)在PCR反应管中按下表所述配置反应体系：

3)将PCR反应管置于ABI7500、Roche LightCycler480、Qiagen Rotor Gene 6000等荧光定量PCR仪中，并按下述反应条件进行检测：

第一阶段：42℃，30min；

第二阶段：95℃，3min；

第三阶段：95℃，10s，60℃，45s，45个循环；

并于第三阶段60℃时同时采集不通通道的荧光信号。