[发明专利]一种高脂血症转基因小型猪及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明提供一种高脂血症转基因小型猪，同时还公开了其制备方法，用于研究人类高脂血症相关疾病的发病机制及相关症疾药物干预与治疗的筛选与临床前预试，为建立人类疾病高脂血症提供了动物模型，属于生物医学技术领域。 

背景技术：

猪的主要生化指标、代谢特点都与人更相似，其脂蛋白结构与组成、脂质代谢机制也近似人类，而且随着年龄增长，猪也可自发动脉粥样硬化。因此，基因修饰猪的研究获得了众多科学家及投资家的青睐，成功实例也证明了其在生命科学研究中具有独特的优越性和实用价值。小型猪比家猪体形小，更易于在动物室喂养，是研究高脂血症和动脉粥样硬化的良好模型动物。药效评价的核心是疾病理想的动物模型的建立。传统的高脂血症动物模型是通过喂饲高脂食物或通过化学诱导的方法制备，但是周期长、血脂水平稳定性差，限制了其在药物评价中的作用。载脂蛋白CIII(ApoCIII)参与富含TG脂蛋白的生成。研究发现ApoCIII能抑制脂蛋白脂酶(LPL)，而后者是清除血浆脂蛋白中甘油三酯的限速酶。血浆ApoCIII浓度与甘油三酯水平呈正相关。在转基因鼠研究中，大量表达人ApoCIII基因可以造成高甘油三酯血症。但未见表达人ApoCIII基因的转基因猪的报道。 

发明内容：

本发明提供一种高脂血症转基因小型猪，此小型猪对探讨高脂血症相关疾病病因、发病机理和基因治疗方法，研究基因表达调控以及进行药物干预和新药的开发试验等，都将具有极为重要的意义。 

本发明公开了上述高脂血症转基因猪的制备方法。 

本发明高脂血症转基因小型猪，其特征如下： 

一种高脂血症转基因小型猪，其特征在于：该转基因猪含人类跨ApocIII的长9970个碱基的一段DNA，含有5′和3′的侧翼片段，以及组织特异性表达调控区。该人类ApocIII基因在猪体内进行了组织特异性表达，ApocIII的过表达抑制了猪体内脂蛋白脂酶的作用，造成猪的血脂升高。 

本发明高脂血症转基因小型猪的制备方法，包括以下步骤： 

采用基因工程的方法构建表达人载脂蛋白CIII(Apolipoprotein CIII)表达载体pcDNA-CIII； 

通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以表达人载脂蛋白CIII的小型猪成纤维细胞；并进行细胞水平的鉴定。 

利用体细胞核移植技术进行小型猪克隆。 

具体制备工艺如下： 

1.载体的构建： 

其基本过程为：人类的跨ApocIII的长9970个碱基的一段DNA(含有5′和3′的侧翼片段，以及组织特异性表达调控区)，位于XbaI限制性内切酶酶切位点之间，正向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，命名为pcDNA-ApocIII。构建示意图见图1。 

经过酶切鉴定与测序后，采用北京天根公司的大提试剂盒，对载体进行大提质粒，用于细胞转染。 

2.ApoCIII转基因小型猪成纤维细胞的构建： 

本发明将构建的表达人载脂蛋白CIII的pcDNA-ApocIII载体线性化后(NotI酶切)，利用FU GENE HD转染小型猪胚胎成纤维细胞，用G418筛选5～7天后，获得抗性细胞。采用一系列的方法对所获的细胞在基因水平(PCR)、转录水平(RT-PCR)和翻译水平(WESTERN BLOT)进行鉴定，获得了表达人载脂蛋白CIII的转基因小型猪的成纤维细胞，为获得ApocIII转基因小型猪奠定了基础。 

3.利用体细胞核移植技术制备ApocIII转基因小型猪 

本发明采用体细胞核移植技术，以红色杜洛克母猪做代孕母猪，制备ApocIII转基因小型猪，产生的ApocIII转基因小型猪的品系为白色中国小型猪。(图2) 

4.对ApocIII转基因小型猪的鉴定 

本发明采用1、PCR和Southern Blot，2、RT-PCR、Western Blot，3、血浆脂质分析(血浆甘油三酯含量，FPLC快速蛋白液相色谱分析)，4、脂蛋白脂酶活性分析以及5、转基因小型猪脂负荷实验验证ApocIII转基因小型猪的整合及表型。 

4.1检测ApocIII转基因小型猪基因整合情况