[发明专利]革囊星虫纤溶酶及其制备方法

权利要求书

1.一种革囊星虫纤溶酶，其特征是革囊星虫纤溶酶从新鲜革囊星虫的体腔液和内脏组织提取，其物化性能为：同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性；其分子量在28000-32000之间，等电点在4.6-6.6之间，纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，对pH值的稳定范围在5.0～9.0。

2.如权利要求1所述的革囊星虫纤溶酶，其特征是纤维蛋白溶解活性最适温度为40℃，最适pH值为8.0。

3.一种革囊星虫纤溶酶的制备方法，其特征是步骤为：

第一步，采用生化层析方法提取纯化从革囊星虫获得纤溶酶，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定纯度，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量，等电聚焦电泳测定等电点；

第二步，应用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性及其纤溶性质鉴定，测定热稳定性和pH稳定性；

第三步，体外血凝块溶解试验及小鼠皮下出血毒性试验。

4.如权利要求3所述的革囊星虫纤溶酶的制备方法，其特征是制备工艺为：

a.革囊星虫纤溶酶的分离和提取：

新鲜革囊星虫洗净，取体腔液和内脏组织，按比例加入预冷的pH6.5～8缓冲液，高速匀浆，离心，取上清液，选择分子量分离范围在2.7～3.5万的凝胶过滤填料和在pH6.5～8范围内能吸附革囊星虫纤溶酶的阴离子交换填料进行层析分离，收集具有纤溶酶活性的组分；通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度和分子量，等电聚焦电泳测定等电点；

b.用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性及其纤溶性质鉴定：以尿激酶为对照品，纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性与活力；分别将尿激酶和纯化的纤溶酶加到加热和不加热纤维蛋白平板中测定纤溶酶活性，在4℃～80℃范围测定温度对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适温度；在pH3～12范围测定pH对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适pH；

c.体外血凝块溶解试验：从兔子颈总动脉取血，体外制备血凝块称重后放入编号的试管中，加入生理盐水和不同活力的纤溶酶溶液(1000U、500U、250U)及1000U尿激酶，置37℃水浴保温24h后取出称重，计算血凝块的溶解率；

小鼠皮下出血毒性试验：在小鼠背部皮下注射革囊星虫纤溶酶0.1ml/点，24小时后剥皮观察皮下是否出现瘀血斑；注射前革囊星虫纤溶酶用生理盐水稀释成500U/ml；

d.结果评定：

本发明的革囊星虫纤溶酶，在加热板上和不加热板上都有纤维蛋白溶解圈，不加热板上溶解圈大于加热板，尿激酶仅在不加热板上有纤维蛋白溶解圈；由此证实此蛋白酶同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性；其分子量在28000-32000之间，等电点在4.6-6.6之间，此纤溶酶的纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，最适温度为40℃；其对pH值的稳定范围为5.0～9.0，最适pH值为8.0。