[发明专利]一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法

权利要求书

1.一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，其特征在于：

以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下：

f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，

r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；

f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，

r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；

f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，

r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；

f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，

r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；

将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK-int，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK-int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303；

用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK-int-FR303和植物表达载体pJIM19，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19载体中，即为构建成功的植物表达载体pJIM19-MRDV303；

将植物表达载体pJIM19-MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述主要步骤：

(1)、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建

A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列

以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增：

具体步骤如下：

1)PCR扩增获得第一段序列：

首先合成目的基因片段的中间部分片段F0，即具有如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，再以F0为初始模板、以上游引物f1和下游引物r1进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f1       0.5μL，

下游引物r1       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s；30个循环；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第一段序列；

2)PCR扩增获得第二段序列：

以步骤1)的产物为模板，以上游引物f2和下游引物r2进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer  2.0μL，

dNTPs           1.6μL，

Mg²⁺            1.2μL，

DNA模板         1.0μL，

上游引物f2      0.5μL，

下游引物r2      0.5μL，

rTaq酶          0.2μL，

ddH₂O           13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第二段序列；

3)PCR扩增获得第三段序列：

以步骤2)的产物为模板，以上游引物f3和下游引物r3进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f3       0.5μL，

下游引物r3       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第三段序列；

4)PCR扩增获得目的基因序列：

以步骤3)的产物为模板，以上游引物f4和下游引物r4进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f4       0.5μL，

下游引物r4       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s；30个循环；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到目的基因序列；

将扩增产物目的基因序列在1％琼脂糖凝胶上分离、回收和纯化，得到纯化的回收产物；

5)连接和转化：

①回收产物连接到pMD-18T

反应体系如下：pMD-18T载体1μL，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL；

16℃连接12小时，得到连接产物；

②转化大肠杆菌DH5α

感受态细胞的制备：

a.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于1ml LB液体培养基中，37℃、225r/min振荡培养过夜；

b.取500μL活化过夜的菌液于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；

c.将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min；

d.在预冷至4℃的离心机中，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体；

e.加入20mL冰冷的0.1mol/L CaCl₂于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min；

f.4℃下，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2mL冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用；

转化步骤如下：

a.将连接产物加入200μL感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min；

b.42℃热击1min 30s，冰浴2min后加入预热至37℃的LB液体培养基600μL；

c.37℃、100r/min低速振荡培养50min；

d.在每个含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上加100μL菌液，均匀涂于平板上；

e.37℃培养箱中培养16小时；

6)阳性克隆的筛选：

以前述步骤4)得到的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r5扩增全长目的基因序列：

f5：CCTGCTCAAATGGGAATA，

r5：AACGAATGACGCTACTGC；

①挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时；

②以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下：

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer      2.0μL，

dNTPs               1.6μL，

Mg²⁺                1.2μL，

DNA模板             1.0μL，

上游引物f5          0.5μL，

下游引物r5          0.5μL，

rTaq酶              0.2μL，

ddH₂O               13.0μL；

③PCR反应扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；

72℃，5min；10℃保温；

将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离；

④测序：通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列是否一致；

B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F303

1)PCR扩增获得正向片段：

以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F1和R1，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全；引物序列如下：

F₁：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，

R₁：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F1 5pmol，下游引物R1 5pmol，TaqDNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR反应程序为：先94℃ 4min；再94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；最后72℃延伸5min；

将扩增得到的产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，得到正向片段PCR产物；

2)PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：

①PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物10.0μL，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

②中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH₂O加至终体积20μL；

37℃温育4小时，将得到的酶切产物在1.0％琼脂糖凝胶上分离，再回收和纯化，得到纯化的回收产物；

3)正向片段连入中间载体：

①回收产物连接到中间载体pSK-int

10μL反应体系为：pSK-int中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收正向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；

16℃连接10h；

②转化大肠杆菌DH5α，方法同前述步骤A5)；

4)正向片段阳性克隆的筛选：

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h；

②取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液  2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₁ 5pmol，引物R₁ 5pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1)；

③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303；

C.构建含反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303

1)PCR扩增获得反向片段：

以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₂和R₂，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全；引物序列如下：

F₂：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，

R₂：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10ng，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂ 5pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

2)反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：

①PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL，SpeI 5U，PstI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

②中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL，SpeI5U，PstI 5U，ddH₂O加至终体积20μL；

37℃温育4小时；

③酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同；

10μL连接体系为：pSK-int-F303中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收反向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；

16℃连接12h；

3)反向片段阳性克隆的筛选：

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h；

②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂ 5pmol，TaqDNA聚合1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303；

D.构建含反向重复序列的表达载体pJIM19-MRDV303

1)XhoI和SpeI双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303

30μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL，pSK-int-FR303 15.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

37℃温育30分钟；

2)XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19

30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJIM1910.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

37℃温育2小时；

3)酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行；T4DNA连接酶连接；

10μL连接体系为：10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL，植物表达载体的大片段2μL，T4DNA连接酶350U，ddH₂O加至终反应体积10μL；16℃连接10h；

4)阳性克隆的筛选

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时；

②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂ 5pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

③PCR呈阳性的克隆在20mL含有50g/mL卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒；XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，在本发明中命名为pJIM19-MRDV303；

(2).农杆菌介导法转化优良玉米的胚性愈伤组织及植株的再生

A.植物表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌：

①农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存的EHA105于含有50g/mL利福霉素平板划线，28℃培养2天；挑取单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，225r/min，28℃振荡培养12小时左右；将5mL菌液转接于100mLYEP液体培养基中，28℃，225r/min，振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌50mL的离心管，5000g离心5min，去上清液；加入1mL预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清；加入200μL预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮；混匀后立即冻存于-70℃，备用；

②表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌

取0.5g左右的pJIM19-MRDV303质粒DNA加入到200L EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮中速冻1min；取出后37℃水浴5min；冰浴2min；加入800L YEP液体培养基，28℃，150r/min振荡培养4h，然后取200L菌液涂布在含50g/mL卡那霉素和50g/mL利福霉素的YEP平板上，28℃培养到形成单菌落；

③阳性克隆的鉴定

挑取转化后长出的农杆菌单菌落接种于含50g/mL卡那霉素和50g/mL利福霉素的YEP液体培养基中，28℃，225r/min振荡培养12h，用菌液作模板进行PCR检测；

PCR反应体系及扩增程序同上述步骤(1)D 4)；

B.农杆菌浸染：

将含有目标载体pJIM19-MRDV303的农杆菌接种到含50mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEP培养基，于28℃培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEP培养基中，28℃、225r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮；将待转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸染5-10min；

C.共培养：

浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上，吸干多余水分后接种到共培养基；用保鲜膜封好平板，22℃暗培养3d；

D.清洗及恢复培养：

共培养3d后的愈伤组织用5mL含250mg/L噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗3次，置于灭菌滤纸上吸干多余水分后，接种到恢复培养基上；用保鲜膜封好平板，25℃暗培养5d；

E.筛选转化子：

恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上；每两周后将抗性愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上；连续筛选3代，草丁膦浓度按1.5mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L递增；每次转接都淘汰褐色的愈伤组织；

F.转基因植株的再生：

选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基上，所述的分化培养基为：N6盐和维生素+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+水解酪蛋白100mg/L+KT 1mg/L，pH 5.8；25℃光照培养16小时/d；2-3周后，将分化出的幼苗转接到生根壮苗培养基上，所述的生根壮苗培养基为：MS盐和维生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0.25g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8；25℃光照培养16小时/d，即得到T0转基因植株。