[发明专利]一种大豆叶片特异性启动子SRS4及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，确切地说是大豆叶片光控基因SRS4启动子及其在转基因植物中的应用。

背景技术

大豆为蝶形花科大豆属一年生草本植物，种子含有丰富的蛋白质，原产我国，至今已有5000年的种植史。大豆不仅是重要的食用油脂和蛋白食品原料，而且是饲养业重要的蛋白饲料来源，是我国重要的粮油作物之一。

我国是大豆生产大国，但由于我国大豆种植面积减少及食用油消费量的不断增长和养殖业发展对豆粕需求的增加，导致我国大豆需求量迅速增加，如今我国也成为世界最大的大豆净进口国。

目前，利用传统育种，改良栽培等方法提高大豆产量已陷入瓶颈；因此，利用基因工程来获得优质高产和稳产大豆是我国的当务之急。

植物基因工程研究的主要内容是基因的表达和调控，但外源基因表达量不足是不能获得理想转基因植物的重要原因。启动子在决定基因表达方面起着关键作用，因此选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的首要问题。

组成型启动子在转基因植物应用中暴露出一些问题，如：外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡；有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。因此，人们必需寻找特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控外源基因表达。

1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物中，是光合植物叶片中含量最丰富的蛋白质，约占可溶性总蛋白的50％；也是光合作用中的关键酶。Rubisco由8个大亚基(rbcL)和8个小亚基(rbcS)组成，其中由核基因编码的小亚基基因的表达受光调控，并具有组织特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆叶片特异性启动子SRS4。

一种大豆叶片特异性启动子SRS4，它的碱基序列如SEQ ID No.1所示；

它是以大豆“吉农13”基因组DNA为模板，以

SS：5`-GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3`SA：5`-TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3`为引物，通过PCR方法扩增获得。

一种含有碱基序列为SEQ ID No.1基因的植物表达载体。

本发明另一个目的是，一种大豆叶片特异性启动子SRS4，在转基因植物中的应用，特别是转基因大豆中的应用。

本发明一种大豆叶片特异性启动子SRS4，是用本发明人独特发计的引物，以大豆“吉农13”基因组DNA为模板，采用TAIL-PCR克隆了大豆rbcS基因SRS4启动子5`侧翼，根据TAIL-PCR所得序列和已知序列设计特异引物，克隆大豆rbcS基因SRS4启动子，并构建其植物表达载体，用农杆菌介导的烟草遗传转化，表达GUS基因的方式进行筛选，筛出一种叶片特异性光控启动子SRS4。

1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物中，具有双重功能，既能催化RuBP与CO₂形成3-磷酸甘油酸的反应，又能催化RuBP与O₂氧化裂解形成3-磷酸甘油酸、磷酸和磷酸乙醇酸的加氧反应；因此，RuBP羧化酶是处于光合碳还原和光合碳氧化两个相反方向但又相互连锁的循环交叉点上，它的含量和活性变化对植物净光合效率起着决定性作用；为建立植物转基因表达的时、空、量三维调控系统奠定理论基础；对研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白、提高产量有着重要的意义。

附图说明

图1为TAIL-PCR产物的电泳分析，M：DL2000；1，2，3泳道：AD2和特异引物组合所得的第1，2，3轮PCR产物；

图2为大豆rbcS启动子SRS4的电泳分析，M：DL2000；1：大豆rbcS启动子的PCR产物。

图3为重组质粒的PCR及酶切鉴定，M：DL2000，1：重组质粒的PCR鉴定，2：重组质粒的双酶切鉴定。

具体实施方式

实施例1  提取大豆“吉农13”基因组DNA

将大豆“吉农13”种子播在装好砂的营养钵中，放在RXZ型智能人工气候培养箱中培养。种子出芽前采用暗培养，出芽后采用Hoagland营养液培养，白天25℃，黑夜16℃，光照16h/d，光强3000lx，相对湿度75％；取生长2周的大豆幼苗嫩叶，按照AxyPrep基因组DNA小量提取试剂盒进行，提取大豆“吉农13”基因组DNA；