[发明专利]用质谱技术进行HPV定量的方法

说明书

发明领域

本发明涉及人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)的检测方法，特别是用质谱进行HPV分型和定量的新方法。

发明背景

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，简称HPV)是一种小型、无包膜的DNA病毒，其具有双链闭环的DNA基因组，大小约为7.2-8kb，相对分子量约为5×10⁶。HPV基因组可分为3个区域：非编码的上游调节区；早期开放读码区，包括E6、E7、E1、E2、E4、E5；晚期开放读码区，编码主要衣壳蛋白L1和小衣壳蛋白L2。根据编码主要衣壳蛋白L1的开放读码框(ORF)基因序列的不同，可以对HPV进行分型：将L1区ORF的相似性小于60％的HPV分为不同的属，相似性在60-70％之间的HPV分为不同的种，相似性在71-89％之间的HPV则分为不同的型别。目前已鉴定的HPV约有130多型，根据其病毒致病力大小，可分为高危型HPV，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73等，以及低危型HPV，如HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等。高危型HPV可致宫颈上皮内瘤病变(CN)，多见于高龄妇女，不易自然缓解，与宫颈癌的发生关系密切。低危型HPV多见于年轻妇女，自然缓解率高。

目前HPV检测技术主要包括第二代杂交捕获技术(HC2)，荧光定量PCR、采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测。其中HC2已成为临床HPV检测领域的金标准。

第二代杂交捕获技术(HC2)是美国Digene公司发展的、唯一获得FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV DNA的技术。该技术的原理是对抗体捕获信号进行放大和对化学发光信号进行检测。该方法使用高危型和低危型核糖核酸探针，能检测13种高危型HPV(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)，是一种易于操作的液基杂交检测方法。然而，该方法并不能对HPV进行精确分型，也不能检测多重感染，并且当任何一种型别的HPV DNA超过阈值时，其检测结果均为阳性。此外，高危型探针还可与其他型别的HPV(例如HPV 53、66、67和73)发生交叉反应，产生假阳性结果，降低实验特异性。

荧光定量PCR(FQ-PCR)在常规PCR的基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结果自动化分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。该方法通过探针杂交进一步提高了HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临床工作和大规模筛查。然而，目前该方法主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV亚型。同时，与HC2一样，荧光定量PCR也不能实现对HPV进行精确分型，即不能明确HPV感染型别。

采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测可以同时检测HPV型别的一种或几种，并能准确对HPV进行定量，其具有高灵敏度，高特异性和高通量的特点，且相对于其它的检测方法成本低。然而，目前利用质谱技术定量HPV的方法主要利用寡核苷酸(oligo)来对HPV DNA样品进行定量，由于oligo价格昂贵、设计复杂且为一次性使用，因此，该方法在实际生产中的应用受到了很大的限制，无法满足大规模测序和定量的生产需要。

因此，迫切需要开发成本低，且能够实现HPV分型和定量检测的新方法，以适应我国现有的大规模测序和定量的生产需要。

发明内容

本发明至少部分地基于下述原理：根据待检测的HPV型别的碱基序列设计突变质粒，该突变质粒含有HPV型别特异性DNA片段，并且该DNA片段与该HPV型别的野生型DNA片段只相异于一个碱基；将该突变质粒作为竞争子与样品混合，并进行采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)的质谱检测法；根据获得的质谱峰图确定HPV的型别，并利用质谱分析软件确定各个峰的峰面积数值，从而计算出样品中的HPV与竞争子的浓度比；根据已知的竞争子的浓度，确定样品中HPV的含量，实现对样品中的HPV进行定量的目的。