[发明专利]具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用

说明书

本申请是申请日为2008年1月23日、申请号为200810004736.0、发明名称为“具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸及其应用。

背景技术

上世纪八十年代日本学者发现卡介苗(BCG)中的DNA组分在人和动物体内具有抗肿瘤活性，后来研究反义核酸治疗的科学家又发现人工合成的硫代寡聚脱氧核苷酸存在非特异的免疫刺激活性。Krieg AM等在《Nature》1995，第374卷、第546-549页中揭示了这些现象的本质，发现核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有非甲基化5′-CpG-3′二核苷酸的六核苷酸序列，特征为5’-PuPuCpGPyPy-3’(Pu代表嘌呤A或G；Py代表嘧啶C或T)，如5’-GACGTT-3’等。其中，核心核苷酸C和G为其活性所必需，两端各两个核苷酸也与其活性紧密相关。上述六核苷酸特征序列称作CpG基元(CpG motif)，含有CpG基元的寡聚脱氧核苷酸统称为CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)。含有上述特征的CpG-ODN对小鼠具有良好的免疫刺激活性，动物实验结果显示了CpG-ODN在疫苗佐剂、肿瘤预防和治疗、感染预防和治疗以及过敏预防和治疗等领域具有良好的应用前景。但是进一步研究发现其免疫刺激活性具有种属特异性，因此阐明活化人免疫细胞的CpG基元和CpG-ODN是将CpG-ODN应用于人体临床的必要前提。Krieg AM等在《The Journal of Immunology 2000，第164卷、第1617-1624页中报道了第一个能够活化人免疫细胞的CpG基元5’-GTCGTT-3’。由此衍生的CpG-ODN(如CpG-ODN 2006)在体外对人免疫细胞具有良好的免疫刺激活性，而且目前多个人体临床研究也证实了CpG-ODN 2006在疫苗佐剂、肿瘤治疗以及感染治疗等领域的免疫效果。根据Krieg AM等研究结果，上述CpG-ODN是人特异的，对小鼠没有活性，因此只能用猴子等灵长类动物作为动物模型来评价这些序列在体内的免疫刺激活性，这增加了实验的难度，例如成本增加、动物来源难于获得等。因此，发现一种非种属特异性的广谱CpG-ODN是十分有必要的。

对于有关CpG-ODN的研究在文献《中华微生物学和免疫学杂志》2001，21(5)，第471-475页、《动物医学进展》2004，25(4)，第25-28页、《Gene Therapy》1996，第6卷，第893-903页中有所描述。另外，专利文献CN 1271733A、CN 1526718A、US 2005/0267057A1或WO 99/56755中也公开了一些CpG-ODN及其相关的应用，但是在上述文献中，均未公开有关具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)的核苷酸，也未公开任何有关包含该基元的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的技术启示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非种属特异性的、具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。更具体地说，本发明提供了一种对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸。

本发明的目的还在于提供该具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸在制备疫苗佐剂以及在制备预防或治疗肿瘤、感染和过敏的药物中的应用。

本发明人在现有技术的基础上进行研究，发现：(1)活化人免疫细胞的CpG基元为5’-NTCGTPy-3’(其中N代表A、G、C或T，Py代表嘧啶C或T)；(2)活化小鼠免疫细胞的CpG基元为5’-NA/TCGTT-3’(其中N代表A、G、C或T)。在此研究基础上，发现出含有5’-NTCGTT-3’基元(包括5’-ATCGTT-3’、5’-GTCGTT-3’、5’-CTCGTT-3’和5’-TTCGTT-3’)的CpG-ODN对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性。发明人进一步研究表明，核苷酸序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元(N不代表A或G)是本发明所述的硫代寡聚脱氧核苷酸对人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的关键。

鉴于此，本发明提供了一种具有免疫刺激活性的硫代寡聚脱氧核苷酸，其序列中具有两个或两个以上拷贝的5’-NTCGTT-3’基元，所述N不代表A或G，优选为T或C。所述硫代寡聚脱氧核苷酸的长度为15～35个核苷酸，优选为20～30个核苷酸。所述CpG是非甲基化的。

当N为T时，所述硫代寡聚脱氧核苷酸的序列优选为：