[发明专利]利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的工业化方法

说明书

技术领域

本发明属于食品科学领域，具体涉及一种利用细胞工程法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的方法。

背景技术

甜味抑制剂是通过阻塞甜度和味觉的受体，从而控制或降低含糖食品的甜度的一类新型添加剂。国内很多传统食品，如蜜饯、月饼、巧克力等，都是以蔗糖作为防腐剂的，在达到防腐的同时，不同程度的存在着过甜的问题。而使用了甜味抑制剂后，既能发挥蔗糖的防腐、改善质构等功能，又不会使食品过甜而影响口感。因此甜味抑制剂的应用前景十分广泛。

2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸是一种对蔗糖及其它甜味剂都有效的甜味抑制剂，其天然存在于咖啡豆中，属天然等同香料。国际食品香料工业组织(IOFI)指出2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸及其钠盐具有相同的性质，是一种安全的、可以在食品工业生产中添加食用添加剂，其添加量为50-150mg/L。目前，生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的主要作物为咖啡豆，但天然咖啡豆中的2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸含量仅为0.55～1.2mg/kg。植物提取法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸受季节气候等条件的影响，产量较低，使其在食品工业中的应用受到了限制。此外，化学合成法也用于生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸，但合成过程易产生副产物及化学异构体。

咖啡树属茜草科的常绿乔木，属是国际市场上重要的农产品之一。咖啡的种植主要集中在非洲和印度尼西亚及中南美洲，正常种植的咖啡树一般3～5年才开始产果。咖啡干豆含有40～50％的多糖类、粗蛋白、有机酸、生物碱和丰富的矿物元素。目前，在我国咖啡豆主要依靠进口获得，尽管近年来世界咖啡豆产量持续增，但相对于日益增长的消费需求仍显不足。关于咖啡豆的细胞组织培养很早就引起了人们的重视，咖啡各种器官和外植体在广泛的培养基上都能有效诱导产生愈伤组织。在所用培养基中，采用加入细胞分裂素和生长素的MS培养基能使大多数外植体愈伤组织发育最好。目前，咖啡豆细胞培养主要集中在生产咖啡芳香剂和研究咖啡因、绿原酸合成等，关于通过咖啡豆细胞悬浮培养生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸没有报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种利用植物细胞培养技术，通过咖啡豆细胞悬浮培养法生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的方法，具有生产周期短，产率高，成本低等特点。

本发明具体的技术方案如下：

一种利用咖啡豆细胞生产2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸的方法，包括以下步骤：

(1)诱导咖啡豆离体器官形成愈伤组织：经消毒处理的咖啡豆在诱导愈伤组织的培养基中，控制温度25～30℃，pH值5-6，暗或弱光培养3-6周，离体器官形成愈伤组织；所述诱导愈伤组织的培养基是在MS基础培养基中添加维生素，生长素和细胞分裂素；以在改良MS培养基中的浓度计，其中维生素添加量为：10～15mmol/L泛酸钙、0.5～0.6mmol/L肌醇、8.0～8.5μmol/L烟酸、3.0μmol/L盐酸硫胺素、5.0μmol/L盐酸吡哆醇和0.04mmol/L生物素；所述生长素添加量为1～12μmol/L，采用2，4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D)，萘乙酸(简称NAA)或吲哚乙酸(简称IAA)；所述细胞分裂素添加量为0.4～0.5μmol/L，采用6-呋喃甲基腺嘌呤(简称KT)、6-苄基腺嘌呤(简称6-BA)和玉米素(zeatin)中的一种；

(2)愈伤组织的继代培养；优选生长良好，祛除发黄生长不良的愈伤组织进行继代培养，继代培养所用培养基同步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基，培养温度25～30℃，暗培或间歇光照培养2～3周，更换新鲜培养基1～3次；

(3)筛选高产悬浮单细胞系；优选生长良好，颗粒状的愈伤组织放入内含液体培养基中，转速为100-120r/min，温度为25-30℃条件下，暗培养6-10天，培养出悬浮单细胞系，将悬浮单细胞系再接种于平板固体培养基上，25～30℃，暗培养18-22天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产悬浮单细胞系；所述液体培养基是在步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基中添加0.2～0.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.05～0.2mg/L 6-呋喃甲基腺嘌呤；所述平板固体培养基的组成与步骤(1)的诱导愈伤组织的培养基相同；