[发明专利]制备碳水化合物酯的方法

权利要求书

1.制备碳水化合物酯的方法，所述方法包括将酰基供体、酰基受体与水混合以产生含5-98％水的高水分环境，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，且所述酰基受体是碳水化合物；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种：醇解或酯基转移作用。

2.权利要求1的方法，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。

3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括纯化所述碳水化合物酯。

4.权利要求1-3之一的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征是，其为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。

5.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是在使用“经缓冲的底物中的转移酶测定法”检测时具有至少2％酰基转移酶活性的脂质酰基转移酶；所述转移酶测定法包括以下步骤：

i)将450mg磷酸卵磷酯和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥；

ii)将300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml 50mM HEPES缓冲液pH 7，并在搅拌过程中使脂质分散到缓冲液中；

iii)在使用磁力搅拌器混和的同时，将底物加热至35℃，并添加0.25m1酶溶液；

iv)在反应0、5、10、15、25、40和60分钟后取出2ml样品，并立即添加25μl 4M HCl以酸化游离脂肪酸，终止酶反应；

v)添加3ml氯仿，并剧烈摇晃振摇30秒，将样品离心，分离2ml氯仿相，并用0.45μm的滤纸过滤，进入10ml涂焦油的Dram玻璃杯中；

vi)在60℃氮蒸汽条件下蒸发氯仿，并称量样品；

vii)通过GLC分析提取的脂质。

6.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶被分类为E.C.2.3.1.x。

7.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生物体获得：气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。

8.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下氨基酸序列：(i)SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ ID No.3所示氨基酸序列；(iii)SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v)SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi)SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii)SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii)SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix)SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x)SEQ ID No.26所示氨基酸序列；(xi)SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii)SEQ ID No.30所示氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或者与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任意一种序列具有75％或75％以上同一性的氨基酸序列。

9.脂质酰基转移酶在制备碳水化合物酯中的用途，所述制备通过在酰基供体、酰基受体与水的混合物中催化醇解和/或酯基转移作用来实施，所述混合物包含5-98％水、其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，所述酰基受体是碳水化合物。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。