[发明专利]一种检测中国地方黄牛AQP9基因单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以黄牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及一种检测黄牛AQP9基因的单核苷酸多态性的方法。

背景技术

近年来肉牛产业呈超高速发展态势，已经成为各国国民经济和农业的重要产业，我国肉用牛的发展还有着巨大的潜力。为了在国际市场获得竞争力，肉类生产者以消费者食物需要为基础，在保证肉品安全质量的前提下尽力提高肉畜的生产性能。这对于育种工作者来说就是如何生产出消费者欢迎的畜产品，同时获得最大效益，也就是说要培育出饲料利用率高，产品品质好的畜禽品种(系)。饲料利用率的高低，归根结底是能量利用的高低。同时就黄牛而言，肌间脂肪是影响其口味的重要因素，它是靠脂肪的沉积和合理分配形成的。随着市场经济的迅速发展人民生活水平的日益提高，加快黄牛生长速度和提高肉品质势在必行。

生长发育性状是典型的、具有重要经济价值的数量性状，其遗传力低，一般为0.2～0.3，用传统育种方法进行育种进展缓慢。而分子育种技术，则是从操纵数量性状的表型逐步过渡到操纵数量性状的基因型，从由表型的选择转为标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)，最终可实现分子育种(molecular breeding)。随着分子生物学和分子遗传学的发展，分子标记也在不断向前发展。在分子标记的发展历程中，其大致可分为三类：I类是以分子杂交为基础的分子标记，如RFLP和DNA指纹；II类是以PCR为基础的分子标记，如RAPD、微卫星标记、PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR-RMAPD(随机扩增微卫星引物多态DNA)标记；III类是以DNA测序为核心的分子标记，如SNP和EST。

单核苷酸多态性(SNP)通常是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的变化而引起的多态性，包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。根据其在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)三类。其中对于编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。目前SNP检测技术有很多，其中DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法。而其它一些SNP检测方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用。PCR-SSCP作为检测基因突变的一种方法，经不断地改善，其简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，更适合临床实验的需要。因此，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，既准确又实用。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是广泛存在于原核和真核细胞膜上转运水的特异性孔道。其中AQP3、7、9和AQP10之间基因结构和蛋白质序列相近似，除对水分子通透外，对甘油和尿素等中性小分子也具有通透性，成为AQP家族中的第二个亚家族，水-甘油通道(aquaglyceroporin，AQP)。AQP9是1997年Kuriyame等在进行人类脂肪组织基因序列系统分析过程中发现的，之后在白细胞、肝脏、睾丸、脾和脑等器官也都有发现，在人体多种组织均有表达，其分子结构和对水的通透性与其他的水通道蛋白类似，并且观察到AQP9增强了脂肪细胞甘油通透能力，所以认为当脂肪分解在细胞膜之间形成甘油浓度梯度时，AQP9开始转运甘油。另有研究显示，肝细胞膜表面AQP9可以完成甘油的摄入过程。脂肪细胞AQP7将脂肪动员产生的甘油输送到血液，而甘油到达肝脏则需要AQP9完成从血液的摄取过程，最终在肝脏以甘油为原料糖异生补充血糖，因此由AQP7和AQP9协调完成了甘油由脂肪细胞到肝脏的运输过程。AQP9的功能异常将影响糖异生而导致低血糖的出现，并且与胰岛素抵抗也密切相关。大量研究表明，AQP9在维持体内能量代谢与平衡，脂肪合成以及个体的生长发育等方面都具有至关重要的作用。因此，研究哺乳动物AQP9基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。