[发明专利]扁桃EST微卫星标记的筛选方法

说明书

【技术领域】

本发明属于分子生物学DNA标记的筛选与应用领域，具体涉及扁桃的EST(Express Sequence Tag，表达序列标签)微卫星标记的筛选方法。

【背景技术】

扁桃(Amygdalus commumis)又名巴旦杏，属蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物，是一种的经济价值极高的油料树种，其核仁含油量高达55-61％。世界上扁桃有40个种，中国有6种。其中扁桃野生资源仅哈萨克斯坦和我国新疆有天然分布，是珍贵的古地中海第三纪中新世纪的孑遗落叶林树种，有“植物活化石”之称。为了对扁桃栽培种和野生资源进行遗传分析、遗传图谱构建等工作，目前迫切需要相应分子标记技术的开发和应用。扁桃已开展ISSR、RAPD、AFLP等标记研究，但其EST微卫星标记开发国内外尚无报道。

随着分子生物学技术的发展，各种分子标记技术不断出现，大大提高了科研人员对植物进行遗传分析研究的能力，其中以微卫星SSR(Simple Sequence Repeat)，即简单重复序列标记在植物遗传研究上应用最为广泛。SSR广泛分布于动植物基因组中，由几个(多为1-6个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，如(GA)n，(AT)n，(GATA)n等重复(其中n代表重复次数)。SSR标记可分为基因组SSR和EST-SSR，传统的基因组SSR标记开发过程较慢，需要进行基因组文库的构建、重复序列克隆的识别和筛选、测序、引物设计等环节，不仅费时耗力，成本也很高。近年来通过eDNA文库测序得到的表达序列标签EST发展十分迅速，在GenBank中平均每天都有上万个EST公布，因而从EST序列中可迅速寻找到EST-SSR标记。EST-SSR标记不仅具有基因组SSR标记的多态性高、共显性与重复性好等特点，而且开发成本低廉，在种属间有良好的通用性。另外，由于EST-SSR标记来自于基因的编码序列，更容易获得基因表达的信息，为功能基因的直接鉴定提供了重要依据。目前该分子标记已被广泛应用于遗传连锁图谱的构建，种质资源多样性的分析，以及比较基因组学等研究。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种扁桃EST微卫星标记的筛选方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：首先利用GeneBank公布的扁桃的ESTs的序列，经冗余序列去除后，通过微卫星检索软件WebSat进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复且重复单元序列长度大于等于18bp的微卫星进行数据挖掘与分析，从而得到含有微卫星标记的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星EST-SSRs标记，其特异引物序列分别为：AC-SSR14：上游引物：GCAGGACCCATTTAGTTCAATC，

      下游引物GCCATAACAGAGACACAGAGGA；

AC-SSR62：上游引物：TCACCTTCCCTCTTACGTCAAT，

          下游引物：CTCTGATGTGTCGGATCTTCTG；。

本发明的有益效果是能将筛选获得的扁桃EST微卫星标记应用于做扁桃种质资源和遗传多样性的分析、分子群体遗传学和种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究，进一步用于扁桃分子辅助选择育种。

【附图说明】

图1为AC-SSR14EST-SSR标记在不同扁桃样本中的电泳分离图谱

图2为AC-SSR62EST-SSR标记在不同扁桃样本中的电泳分离图谱

【具体实施方式】

本发明下面结合微卫星位点筛选及其多态性标记确定的具体做法予以详述：

1、扁桃ESTs数据来源和微卫星序列的筛选

以扁桃学名从美国国家生物技术中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)的数据库搜索并下载扁桃EST序列(格式FASTA)，利用Repeat Masker(http://www.repeatmasker.org)去除重复序列，以Phrap(http://www.phrap.org)进行核苷酸序列重叠群分析和聚类去除冗余核苷酸序列后应用Websat(http://wsmartins.net/websat/)在线程序搜索SSR。搜索的标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复序列的重复次数分别大于或等于9、6、5、4和3。

2、微卫星标记引物设计