[发明专利]纯化丙酮酸激酶的方法

权利要求书

1.一种纯化丙酮酸激酶的方法，其包括如下步骤：

(1)将发酵液匀浆，得粗酶液；

(2)对粗酶液进行稳定化处理；

(3)对进行稳定化处理后的粗酶液进行热冷处理；

(4)对步骤(3)所得粗酶液进行酸碱处理；

(5)用PEG沉淀法将酶从含杂离子的粗酶中沉淀出来，将沉淀重悬，继续用PEG沉淀法洗去其中残余的杂离子，得酶泥；

(6)将步骤(5)所得的酶泥重悬，加入单宁酸使PEG和单宁酸结合生成沉淀并离心除去，上清液经冷冻升华干燥获得符合试剂盒纯度要求的诊断用酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中，对粗酶液进行稳定化处理包括：调节粗酶液的pH，同时加入适当浓度的稳定剂，以提高酶的稳定性。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，调节粗酶液的pH至4.00-10.50。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的稳定剂为钾盐、镁盐和丙酮酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述的钾盐包括硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、醋酸钾中的一种或两种以上，所述的镁盐包括氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、醋酸镁中的一种或两种以上。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，在粗酶液中同时加入终浓度为1-50mmol/l的钾盐、1-200mmol/l的镁盐和2-50mmol/l的丙酮酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述的热冷处理包括：将步骤(2)所得的粗酶液在50℃-60℃加热10-60分钟，使部分杂蛋白沉淀；之后，将酶液在-20℃--40℃冻结16-20小时，然后在25℃-30℃解冻3-5小时，粗酶液中有大量的杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，在室温下5000G离心40-60分钟，去除此沉淀。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述的酸碱处理包括：将步骤(3)所得到的粗酶液在25℃-30℃下调节pH4.00，保存4-10小时，将pH调节10.50，在25℃-30℃保温20-50小时，杂蛋白发生变性失活并沉淀下来，此沉淀用离心的方法去除。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(5)包括：在步骤(4)所得的粗酶液中，加入粗酶液体积25-50％的PEG溶解，静置，目的蛋白发生沉淀，离心，将含有杂离子的上清液弃除，收集沉淀；此沉淀用3倍体积的Tris-HCl缓冲液重悬，重复以上步骤1次，洗去沉淀中的少量杂离子，收集沉淀，即为酶泥。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述PEG的分子量为1000-20000。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(6)包括：将去除盐离子的酶泥用3倍体积的Tris-HCl悬起，加入酶泥体积0.5-30％的丹宁酸；聚乙二醇和单宁酸形成沉淀，将此沉淀离心去除，收集上清液；此上清液经过真空冷冻升华获得适合血钾检测的原料酶。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，加入的单宁酸的量为酶泥体积的1-20％。