[发明专利]荧光猝灭剂分子及其方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及新的吡啶基-异喹啉-二酮衍生物、制备这些衍生物的方法、包含新的吡啶基-异喹啉二酮衍生物和(i)固相支持体或(ii)生物分子的缀合物、制备这些缀合物的方法以及这些缀合物在荧光共振能量转移(FRET)中作为猝灭剂的用途。

背景技术

荧光共振能量转移(缩写为FRET)，亦称共振能量转移(以其发现者Theodor 命名)，是描述激发能从一个分子转移到另一个分子而无需荧光和重新吸收的机制。按照理论，通过供体荧光偶极子与受体吸收偶极子的偶极子-偶极子耦合进行能量转移。因此，FRET现象总是非辐射能量转移。在吸收某一波长的光后开始处于电子激发态的供体发色团(chromophor)可将能量非辐射地转移至受体，而促使受体处于其电子激发态。随后，受体的电子激发态衰减以致进而放出能量。FRET的效率取决于多个可如下归类的参数：供体与受体之间的距离；供体发射光谱与受体吸收光谱的光谱重叠；以及供体发射偶极矩和受体吸收偶极矩的相对取向。

在常规FRET技术中，供体和受体均为荧光团。因此，由供体荧光团所吸收的某一波长(吸收波长)的光的能量被转移至受体。由于吸收了转移的能量，促使受体成为电子激发态，电子激发态随后衰减，然后被转移至受体的能量发射出某一特定波长(发射波长)的光。与吸收波长相比，发射波长向更长的波长转移。当供体和受体由于发色团的相互作用而紧密靠近时(例如1-10nm)，由于自供体到受体的FRET，因此主要观察到受体发射。因此，可通过供体荧光的减弱或受体荧光的增强来检测FRET现象。

在FRET的一种具体形式中，使用所谓的猝灭剂代替荧光受体(J.R.Lakowicz，Principles of Fluorescence，第二版，Kluwer AcademicPlenum Publishers，New York，1999)。猝灭剂是这样一种分子：它吸收自供体(亦称报道分子(reporter))转移的能量而不再发光，故可猝灭荧光。因此，在报道分子-猝灭剂系统中，供体向猝灭剂转移能量。因此，供体返回基态，并产生猝灭剂的激发态。随后，猝灭剂的激发态非辐射性衰减((黑)暗猝灭剂)。在非辐射或暗衰减中，通过分子振动(热)释放出能量。因为探头中猝灭剂的浓度通常处于μM以下的范围，所以非辐射衰减的热量太小，以致不能影响溶液的温度。根据方程式，这类荧光猝灭还取决于供体与受体间的距离。与上述FRET技术不同，不测量受体的发射，只测量供体的发射：发色团彼此分得越开，得到的能量转移越弱，致使供体的荧光相应地增强。

直到最近几年，猝灭剂一般都是荧光染料，例如作为报道分子的荧光素和作为猝灭剂的罗丹明(FAM/TAMRA探头)。最著名的猝灭剂之一为用来降低报道分子染料(reporter dye)发射的TAMRA(四甲基-罗丹明)。由其性质所致，TAMRA适于作为FAM(羧基荧光素)、HEX(六氯荧光素)、TET(四氯-荧光素)、JOE(5′-二氯-二甲氧基-荧光素)和Cy3-染料(花青)的猝灭剂。

然而，TAMRA的实用性有限，因为其宽大的发射光谱降低了其在多路复用(multiplexing)(当同时使用两个或更多个报道分子-猝灭剂探头时)中的能力。它固有的荧光产生背景信号，导致信号动力学减弱，因此，可能降低基于TAMRA的测定法的灵敏度。

暗猝灭剂为这个问题提供了解决办法，因为它们不占据发射带宽。而且，暗猝灭剂能够多路复用。一种典型的暗猝灭剂是DABCYL(4-[[4-(二甲基氨基)-苯基]-偶氮基]-苯甲酸)，它常常与分子信标联用。DABCYL在380～530nm的范围内猝灭染料。因此，即使具有较长波长发射的荧光团(例如Cy3-染料)也可被DABCYL更好地猝灭。然而，DABCYL具有不适当的吸收谱带，与在480nm以上发射的荧光团的重叠非常差。又一种非荧光染料为猝灭剂(4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺，Epoch Biosciences，Inc.的商标，Corporation Delaware21720，23^rd Drive NE，Suite 150，Bothell Washington 98021，USA)，它在530nm处吸收最大，并且有效猝灭从520nm到670nm的光谱。