[发明专利]6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(S)-羰基还原酶偶联提高(S)-苯基乙二醇转化效率的方法

说明书

技术领域

6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(S)-羰基还原酶偶联提高(S)-苯基乙二醇转化效率的方法，利用基因共表达提高全细胞不对称转化(S)-苯基乙二醇的效率和批次稳定性的方法，本发明涉及利用基因工程的手段，构建了(S)-羰基还原酶（SCRⅡ）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）共表达的重组毕赤酵母菌（Pichia pastoris）SCRⅡG，高效制备(S)-苯基乙二醇，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

光学纯的苯基乙二醇（PED）是液晶材料中不可缺少的手性添加剂，也是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。生物法转化制备光学纯(S)-苯基乙二醇，通常以微生物全细胞或酶为催化剂，采用不同的化学反应途径，如Bakers’酵母不对称还原2-羟基苯乙酮法，环氧化物水解酶催化水解外消旋苯乙烯氧化物法，和萘双氧化酶（NDO）选择性氧化苯乙烯法等，这些方法存在底物浓度低，需要昂贵的辅酶，产物光学纯度低等缺点。氧化还原酶催化的不对称还原反应中，辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。

全细胞体系辅酶再生主要有两种策略：一是在反应体系中添加醇或糖类辅助底物，构成底物耦联再生系统；二是通过基因工程手段在细胞中构建酶耦联再生系统。如Degussa公司利用该辅酶再生的原理催化三甲基丙酮酸不对称还原合成L-叔亮氨酸，大大提高了产物的转化率。ω-转氨酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶组成的耦联体系用于高效转化(R)-苯乙醇。

本实验室已经利用重组菌株催化不对称还原反应，制备(S)-苯基乙二醇，在此基础上，利用基因工程技术，将酿酒酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）基因ZWF1与近平滑假丝酵母(S)-羰基还原酶基因scrⅡ整合至毕赤酵母基因组中，构建了共表达偶联体系Pichia pastoris/SCRⅡG，在5% (w/v) 葡萄糖的参与下，Pichiapastoris/SCRⅡG不对称还原2-羟基苯乙酮的催化效率大大提高，反应十个批次后，产物(S)-苯基乙二醇光学纯度和产率分别高达100%和85%以上。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种基因工程方法构建多酶偶联体系，实现了多种酶功能的成功整合。利用酶偶联后的重组菌株Pichiapastoris/SCRⅡG (菌种保藏号：CGMCC No.4198)高效不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法。本发明根据酿酒酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶和近平滑假丝酵母(S)-羰基还原酶的功能，利用基因工程技术，构建双酶偶联毕赤氏酵母体系，以酶偶联重组菌为催化剂，实现了从2-羟基苯乙酮到(S)-苯基乙二醇的高效转化。在5% (w/v) 葡萄糖的参与下，当底物浓度为6 mg/mL 时，经过十批次的催化反应，产物(S)-苯基乙二醇光学纯度高达100％，产率维持在85%以上。本发明为解除辅酶再生循环的限制，成功整合双酶功能，提高手性醇制备效率提供了一条崭新的思路。

（2）技术方案

一株不对称制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）SCRⅡG ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4198。

利用重组菌CGMCC No.4198不对称转化制备 (S)-苯基乙二醇的方法，不对称转化反应条件：在0.1 mol/L pH 5.5的醋酸缓冲液中，加质量/体积比5%葡萄糖，底物2-羟基苯乙酮的浓度为6 mg/mL，重组菌细胞浓度为0.1 g/mL，不加辅助底物，反应温度为35℃，反应时间为24 h，转速150 r/min，重组菌菌体重复利用十个批次。

反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100) 进

行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6 mm ×25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)，流动相为正己烷/异丙醇（9/1，V/V），流速0.5 mL/min，检测波长为215 nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。