[发明专利]新型完整蛋白质微捕集器的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种新型完整蛋白质微捕集器的制备及其应用。

本发明制备的完整蛋白质微捕集器，可作为两维在线液相色谱中完整蛋白质在两维之间的切换，对一维色谱洗脱下来的蛋白质进行成功地捕集，浓缩及除盐。该微捕集器在蛋白质组学等领域有良好的实用价值和应用前景。

背景技术

蛋白质组学研究中通常有两种主要的研究方法来分析复杂的蛋白质，分别是“bottom-up”和“top-down”。 “Bottom-up”指的是“鸟枪法”蛋白质组学研究方法，该方法在大规模鉴定未知蛋白质方面起着重要的作用。然而，“bottom-up”研究方法提供了完整蛋白质非常有限的分子信息。

与bottom-up相比，top-down的技术方法能够提供完整蛋白质分子水平上的信息，使得我们对完整蛋白质的定量研究及后转移修饰研究成为可能。采用top-down 的技术路线来研究完整蛋白质，在质谱鉴定前有效分离捕集全蛋白至关重要。

相对于两维凝胶电泳技术，由于多维色谱具有自动化、多样性、高通量及高灵敏度的优点，采用多维色谱结合串级质谱来分析复杂的蛋白质混合物具有很强的优势。然而，由于缺乏在线捕集完整蛋白质的技术，多维液相色谱分离的样品大多采用离线浓缩的方式，系统难以实现自动化。

目前商品化的捕集柱主要用于对肽段或其它小分子如痕量环境污染物，药物或生物体液中代谢物等的富集。富集完整蛋白质的捕集柱很少见报道。用捕集肽段的颗粒固定化整体柱进行蛋白质捕集实验发现：部分蛋白质回收率很低，在20%以下。低的回收率是由于这种捕集柱中颗粒表面涂覆有厚厚的溶胶凝胶涂层造成的。与肽段等小分子相比，捕集全蛋白存在着许多困难：蛋白质比肽段复杂得多，蛋白质带有不同的电荷，存在着各种二级三级结构折叠，还包括多种后修饰。肽段与小分子相似，它们扩散进出固定相表面的孔隙比较容易。而这种带有厚厚溶胶凝胶涂层的捕集柱中，固定相表面包覆着多层溶胶凝胶，蛋白质分子很难自由地扩散进出固定相表面的孔隙中，与固定相进行交换平衡。因此发展一种简单便捷而又有效的捕集蛋白质的方法成为蛋白质组学研究的一个重要方面。

为了对完整蛋白质进行有效地捕集并获得高的回收率,微型全蛋白捕集器在结构上应具有以下两个特点：首先，捕集器内部固定相颗粒表面的溶胶凝胶涂层一定要薄。包覆在颗粒表面的膜越薄，蛋白质越容易扩散进出颗粒表面的孔中，传质效率越高。同时，微捕集器的机械强度不能下降。其次，溶胶凝胶网络骨架上的通孔要足够大以保证蛋白质自由地通过溶胶凝胶形成的网络。因此，制备一种溶胶凝胶涂层薄，同时机械强度高的全蛋白微捕集器成为成功捕集蛋白质的关键。

目前,商品化的色谱填料都经过了封端处理，以消除硅羟基的存在，以免造成分离时碱性化合物的色谱峰拖尾。由于硅羟基大量被封闭掉，在进行溶胶凝胶反应时，填料很难与水解后的前驱体反应形成三维的网状结构，得到的微捕集器机械强度很差，填料非常容易被冲散。因此在制备前，要对商品化的色谱填料进行活化处理。

本发明制备了新型薄层溶胶凝胶涂覆的整体型C4，C8和C18微捕集器。利用该微捕集器用于在线多维色谱之间的样品切换，对标准蛋白质及实际蛋白质进行了捕集，浓缩，除盐，从而避免了在后续质谱鉴定中高盐存在对质谱信号的干扰。该全蛋白微捕集器在蛋白质组学等领域有良好的实用价值和应用前景。

发明内容                                               

本发明的目的在于提供一种制备简单、溶胶凝胶涂层薄、机械强度高、寿命长、捕集量高的完整蛋白质微捕集器的制备方法和应用。

本发明提出的完整蛋白质微捕集器的制备方法，首先对商品化的色谱填料进行活化处理。目前商品化的色谱填料都经过了封端处理，以消除硅羟基的存在，以免造成分离时碱性化合物的色谱峰拖尾。由于硅羟基大量被封闭掉，在进行溶胶凝胶反应时，填料很难与水解后的前驱体反应形成三维的网状结构，得到的微捕集器机械强度很差，填料非常容易被冲散。因此在制备微捕集器前，要对商品化的色谱填料进行活化处理。首先采用氢氧化钠溶液分别浸泡处理C4，C8和C18反相色谱填料，以活化表面封端的填料，增加固定相表面裸露的硅羟基数目。将处理后的填料悬浮于以甲基三乙氧基硅烷为前驱体的溶胶溶液中，由加压装置将悬浮液引入到毛细管中适当长度，经前躯体的水解和缩聚制得具有三维网状空间结构的完整蛋白质微捕集器。处理后的C4， C8和C18填料都被成功制得了适用于对完整蛋白质捕集的微捕集器。