[发明专利]一种ATP再生系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种ATP再生系统及其与ATP参与的生物转化耦合中的应用。背景技术

很多酶反应过程涉及能量和辅因子的参与，例如三磷酸腺苷（ATP）、烟酰胺腺嘌呤核苷酸（NAD/NADH、NADP/NADPH）以及辅酶A（CoA）。这些辅因子往往因为价格昂贵，不适合直接加入工业化酶反应生产过程，因此构建这些辅因子的再生系统越来越受到研究人员的关注。其中，ATP作为广泛参与生物反应的辅因子，其有效再生方法更是关注的焦点。

按利用的底物，ATP再生系统可分为转移高能磷酸键的反应系统和利用碳水化合物降解来产生能量的系统。前者应用于ATP再生的含高能磷酸键的化合物主要为以下三种，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、乙酰磷酸和磷酸肌酸，它们的利用还分别要依赖丙酮酸激酶、乙酸激酶和肌酸激酶。尽管这些ATP再生系统产生的ATP可以有效地应用于酶催化反应过程，但这些含高能磷酸键的底物在反应体系中不稳定，容易被磷酸酶水解，且参与反应的酶和底物价格昂贵，在反应中有无机磷酸的积累，因而对很多反应都有抑制作用，因此找到更稳定，更有效，更经济的ATP再生途径是十分必要的。Dong-Myung Kim等（Biotechnology and Bioengineering 2001 74:309-316）认为，若在反应体系中，参与酵解途径的酶都有活性，那么就有可能利用参与酵解途径的任何基质来产生能量，例如葡萄糖-6-磷酸，丙酮酸，甚至是葡萄糖，这些物质相对来说更经济，在反应系统中也更稳定。

葡萄糖被认为是生物技术应用中最经济的能量来源。每mol葡萄糖在酵解途径中可以生成2 mol ATP,经通透化处理的酿酒酵母的酵解途径己被成功地用于很多生物合成反应，如谷胱甘肽，谷氨酰胺，茶氨酸等。

由L-谷氨酸（L-Glu）、L-半胱氨酸（L-Cys）和甘氨酸（Gly）合成谷胱甘肽（GSH）的过程中需要ATP，早期的研究就尝试在GSH生产过程中引入ATP再生系统。Murata等（European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 1980 10:11-21）使用乙酸激酶催化的反应再生ATP，即利用乙酰磷酸作为底物生成乙酸的过程将ADP转化为ATP，与固定化的大肠杆菌生产GSH相耦合。但乙酰磷酸价格昂贵，在水溶液中容易被大肠杆菌的磷酸酶水解，使得这种方法很难得以产业化。Tochikura（Journal of Fermentation Technology 1967 45:511-529）认为酿酒酵母的糖酵解作用是最简单最有可能产业化的ATP再生系统。Murata等（European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 1981 11:72-77）利用酿酒酵母IFO 2044的谷胱甘肽合成体系与自身的糖酵解作用耦合生产GSH，但葡萄糖酵解作用生成的ATP中只有0.5%被用于GSH合成反应。陈坚等（Enzyme and Microbial Technology 2009 46:82-86）将酿酒酵母的ATP再生系统引入大肠杆菌催化的GSH合成，发现大肠杆菌中的腺苷脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶可将耦合体系中的核苷酸不可逆地降解，从而使得葡萄糖的利用和GSH的合成都受到影响，因此他们将大肠杆菌的腺苷脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶基因敲除，6小时反应后GSH可积累10.88mM，比不敲除的对照提高4.03倍。

无细胞蛋白合成是一种以外源DNA或mRNA为模板，利用细胞提取物中的细胞器及相关的酶系，通过添加核苷三磷酸、氨基酸和能量物质来实现蛋白体外表达。与全细胞的蛋白表达系统相比，无细胞蛋白合成具有反应快，产量高，可合成具有功能的、可溶的全长蛋白的优点。此外，无细胞蛋白合成还非常适用于有毒性蛋白的表达，反应可以在短时间内进行，无需繁杂的下游处理，适合于高通量筛选。早期研究者发现，无细胞蛋白合成只能通过分批方式进行，但分批反应只能得到少量的目标蛋白，这是因为蛋白合成反应只能维持很短的时间（一般为20分钟)，驱动蛋白合成的能量物质ATP的快速降解是重要原因之一。