[发明专利]一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法

权利要求书

1.一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将辅酶加入缓冲液中得溶液A，将辅酶辅酶依赖性酶加入缓冲液中得溶液B；将携带活性基团的载体加入到所述溶液A中，得溶液C；将所述溶液C离心，收集载体并将所得载体加入所述溶液B中，混匀得溶液D；

2)将溶液D进行孵育，离心或过滤、洗涤、冷冻干燥即得固定化酶。

2.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述辅酶为辅酶I、辅酶II、核黄素、硫胺素、维生素B₆、维生素B₁₂、生物素、四氢叶酸、泛酸、辅酶A、辅酶Q、硫辛酸、S-腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述辅酶依赖性酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、甘油脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、胆碱脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胍乙酸转甲基酶、组蛋白转甲基酶、胆碱乙酰化酶、磷酸转乙酰化酶、硫辛酸乙酰转移酶、乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、苯丙氨酸羧化酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、赖氨酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、转酮醇酶、NADH-Q还原酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶乙二醛酶、顺丁烯二酸单酰乙酰乙酸异构酶中的至少一种。

4.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、醋酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液、焦磷酸钠缓冲液中的一种。

5.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述活性基团为羟基、氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基中的至少一种。

6.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述载体为壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、硅胶、明胶、藻酸盐、多孔玻璃、聚乙烯亚胺PEI、聚乙二醇PEG、聚丙烯胺PAA、聚苯乙烯、环氧树脂、尼龙、碳纳米管、淀粉、白蛋白、纤维素、有机染料、多溶素、石墨烯、Fe₂O₃、Fe₃O₄、MnFe₂O₄、ZnFe₂O₄、CoFe₂O₄、Ni微粒中的至少一种。

7.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述溶液A的摩尔浓度为0.001mmol/L～10mol/L；所述载体与所述溶液A的比例为1g∶(0.001～1)L，其中载体以质量计算，溶液A以体积计算。

8.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述溶液B中辅酶依赖性酶与缓冲液的比例为(0.01mg～0.5g)∶(0.1～100)mL，其中辅酶依赖性酶以质量计算，缓冲液以体积计算。

9.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于步骤1)中，所述溶液A中加入偶联剂，所述偶联剂为己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯、二缩水石油醚、戊二醛或碳二亚胺；所述载体与所述偶联剂的比例为1g∶(0.01～10)mL，其中载体以质量计算，偶联剂以体积计算。

10.如权利要求1所述的一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于在步骤2)中，所述孵育的条件为：温度4～65℃，时间15min～64h。