[发明专利]氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒-9164

说明书

【技术领域】

本发明涉及医学/食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及氨(氨离子)诊断/测定方法及其试剂盒。

【背景技术】

氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。

扩散法是标本碱化后，释放出NH₃，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％～13％；离子选择电极法是利用NH₃扩散到电极表面，引起电极的pH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％～4.8％，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。

检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种氨(氨离子)的测定方法。

本发明的另一个目的是提供一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定氨(氨离子)的方法。

本发明氨(氨离子)测定方法的的技术原理是根据下述氨激酶、柠檬酸辅酶A连接酶、丙二酸-半醛脱氢酶的系列催化反应完成：

氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺

腺苷二磷酸+磷酸根+柠檬酰-辅酶A柠檬酸辅酶A连接酶

                             腺苷三磷酸+柠檬酸+辅酶A

辅酶A+3-甲酰乙酸+辅酶丙二酸-半醛脱氢酶二氧化碳+

                                乙酰-辅酶A+还原型辅酶

本发明的方法利用氨激酶(ammonia kinase；EC 2.7.3.8)酶(偶)联柠檬酸辅酶A连接酶(citrate-CoA ligase；EC 6.2.1.18)、丙二酸-半醛脱氢酶(malonate-semialdehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.18)酶促反应比色终点法。氨激酶酶解氨反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合柠檬酸辅酶A连接酶、丙二酸-半醛脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算氨(氨离子)的浓度大小。

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种氨(氨离子)的测定方法。该氨(氨离子)测定方法的步骤如下：

A、样品准备：

A.1标准样品的制备

将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将氨浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；

A.2待测样品的制备

待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；

A.3空白样品

所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升；

B、试剂溶液的制备：

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氨激酶、柠檬酸辅酶A连接酶、丙二酸-半醛脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、柠檬酰-辅酶A与3-甲酰乙酸，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-2mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L与1-100mmol/L；