[发明专利]一种rpoB基因突变检测特异性引物和液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种rpoB基因突变检测特异性引物和液相芯片。

背景技术

rpoB基因(RNA Polymerase β-Subunit Gene)是RNA聚合酶β亚基的编码基因，全长3543个碱基，其中，结核分枝杆菌耐利福平的分子机制与rpoB基因相关，利福平通过与RNA聚合酶的β亚单位结合，从而阻碍RNA的转录和延伸。此基因编码507-533氨基酸位点的核心区域是利福平耐药决定区(rifampicin resistance-determining region，RRDR)，当此区域发生突变，包括点突变或短的插入、缺失突变等，DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位酶活性改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合，从而表现为耐药。

rpoB基因突变常见单个碱基突变或数个碱基联合突变，约80％-86％的碱基突变发生在3个氨基酸位点上：即第531位的丝氨酸转换为亮氨酸(TCG→TAC)、第526位的组氨酸转换为酪氨酸(CAC→TAC)、第526位的组氨酸转换为其他氨基酸。其中，此区域65％～86％的突变发生在第526位的组氨酸突变为酪氨酸和第531位的丝氨酸突变为亮氨酸，而且此突变将导致对利福平的高度耐药。此外还有513、516、529、533、545位点的突变也会产生高度耐药，而522位点的突变则产生低水平耐药。因此，检测rpoB基因突变情况具有重要的实际应用价值。

目前对rpoB基因突变的检测产品主要有实时荧光定量PCR、直接测序法、变性梯度凝胶电泳、DHPLC等，存在灵敏度低、样品易污染、假阳性率高、不能确定突变位置、价格昂贵等缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。

发明内容

本发明的目的之一是提供rpoB基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测rpoB基因八种常见突变型codon513(CAA→AAA)、codon 516(GAC→GTC)、codon 522(TCG→TTG)、codon 526(CAC→TAC/CTC/GAC/CGC)、codon 529(CGA→CCA)、codon 531(TCG→TGG/TTG)、codon 533(CTG→CCG)、codon 545(CTG→ATG)的野生型和突变型。

一种rpoB基因突变检测液相芯片，主要包括有：

(A)针对rpoB基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：SEQ IDNO.21及SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.31中的一种以上、SEQ ID NO.32及SEQID NO.33、SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.36中的一种以上、SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、和/或SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20中的序列；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.60中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)用于扩增具有codon513、codon 516、codon 522、codon 526、codon 529、codon 531、codon 533、和/或codon 545的突变位点的rpoB基因目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62。