[发明专利]一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白及其生产方法

权利要求书

1.一种可用于疫苗稳定剂的类人胶原蛋白，其特征在于，由酵母工程菌发酵获得，该酵母工程菌命名为毕赤酵母(Pichia Pastoris)X-33/col CGMCCNo.4187。

2.权利要求1所述酵母工程菌，其特征在于，其染色体上整合一种人工合成的类人胶原蛋白基因col，其碱基序列如下：

GAAGCTGGTTTGCCTGGTGCTAAGGGTCTGACTGGTTCTCCTGGTTCTCCCGGACCCGATGGTAAGACT

GGACCCCCAGGACCAGCTGGTCAAGATGGACGTCCTGGACCTCCAGGCCCTCCAGGGGCCCGAGGCCAA

GCAGGTGTTATGGGGTTTCCTGGACCAAAGGGAGCAGCCGGCGAGCCAGGTAAAGCCGGCGAAAGGGGT

GTCCCAGGACCACCAGGTGCTGTGGGACCAGCCGGCAAAGACGGTGAGGCAGGTGCTCAGGGTCCACCA

GGACCTGCTGGTCCTGCTGGAGAAAGATAA

其核酸长度为306bp。

3.一种权利要求1或2所述类人胶原蛋白的生产方法，其特征在于，

(1)酵母工程菌的构建：

根据已知胶原蛋白氨基酸序列，经酵母密码子偏好性的修饰，最终获得人工合成类人胶原蛋白基因col；

再将人工合成类人胶原蛋白基因col克隆至酵母表达载体pPICZα，命名为pPICZα/col；

利用电击转化方法将重组质粒pPICZα/col转化至酵母细胞X-33；

最后利用PCR和测序的方法筛选正确的酵母工程菌；

(2)酵母工程菌的摇瓶诱导培养：

固体培养基YEPD的成分及其每升含量为：蛋白胨20克，酵母粉10克，葡萄糖20克，琼脂粉15克；

固体培养条件：将酵母工程菌接种到上述固体培养基的培养皿中，于20℃-50℃培养3-5天；

种子培养基的成分及其每升含量为：蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母胆碱YNB13.4克，甘油10毫升，磷酸钾缓冲液0.1摩尔，生物素0.4毫克；

种子液培养条件：用无菌接种环从上述培养皿中取适量菌体，接种到已灭菌的上述种子培养基中，20℃-50℃，220rpm摇床培养12-24小时；

摇瓶发酵培养基的成分及其每升含量为：蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母胆碱YNB13.4克，甲醇10毫升，磷酸钾缓冲液0.1摩尔，生物素0.4毫克；

摇瓶发酵培养条件：收获酵母工程菌的种子液后，离心收集菌体，经发酵培养基洗剂，按照体积比1％-30％接种量将酵母工程菌接种到上述摇瓶发酵培养基中，20℃-50℃，100rpm-300rpm，期间需定期补充甲醇诱导维持体积比的0.5％-5％的浓度，摇床培养1-10天；

(3)类人胶原蛋白的粗提及验证

酵母工程菌发酵结束，离心收集发酵上清液，然后加入质量百分比为60％-100％的硫酸铵或硫酸钠或氯化钠进行沉淀浓缩，最后离心收集沉淀，获得类人胶原蛋白粗品；再经质量百分比为5％浓缩胶和10％-20％分离胶的SDS-PAGE凝胶检测。