[发明专利]一种阳离子聚合物及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型阳离子聚合物及其制备方法和用途，还涉及由该新型阳离子聚合物与核酸构成的纳米复合物及其制备方法和用途。

背景技术

基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的基因通过一定的方式导入靶细胞以纠正基因缺陷或发挥治疗作用，确切地说，它是遗传信息相关的特异性核酸序列的转移，是一项综合性高难度的生物技术。因此，基因治疗的关键问题就是寻找高效、低毒的基因载体。迄今研究开发的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类，其中，病毒载体，如各种逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等，虽然转染效率高，但存在着对外源基因的容纳量少(约4.5-30kbp)、稳定性差、免疫原性高、毒性大、靶向特异性差等诸多缺点；而非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点已经越来越受到国内外学者的高度重视，并被建议替代病毒载体而成为基因载体研究的主要方向。

在非病毒载体研究中，阳离子聚合物基因输送系统已成为基因非病毒载体设计开发的主要方向，例如，对多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯、壳聚糖和聚阳离子环糊精等。遗憾的是，迄今为止研究发现的阳离子聚合物基因输送载体的转染效率都不理想或转染效率较高但由于体内不降解导致毒性太大。因此，寻找新型的高效、低毒的基因非病毒载体已成为基因治疗研究领域最为迫切并具挑战性的课题之一。

带有高正电荷密度的阳离子聚合物可有效压缩DNA形成稳定的纳米复合物，使DNA能被细胞有效摄取并保护DNA在输送过程中免受酶的降解。但高电荷密度的聚合物，特别是不可降解的聚合物，会对细胞造成极大的毒性。此外，当纳米复合物进入细胞后，DNA必须要从复合物中有效解离才能发挥作用，因此过紧的压缩DNA会导致DNA无法从复合物中解离而使转染失败。因此，如何克服聚合物的毒性和转染效率之间以及细胞外DNA的强压缩效果和细胞内DNA的有效解离之间的双重矛盾已成为阳离子非病毒基因输送过程中的难题。

二硫键即S-S键，是由蛋白质的两个半胱氨酸之间配对形成的一种共价键。在细胞中，二硫键可被谷胱甘肽降解。因此，利用细胞内外谷胱甘肽(GSH)浓度差高达三个数量级且谷胱甘肽可降解二硫键的特性，可将二硫键引入到阳离子聚合物内部合成还原响应性的聚合物，该聚合物可在细胞外有效压缩DNA成足够小的纳米复合物利于细胞摄取，并保持DNA在输送过程中稳定。当纳米复合物通过内吞机制进入细胞后，在细胞内高GSH作用下，二硫键断裂，DNA可有效从复合物中解离。此外，在聚合物中引入二硫键可提高聚合物的降解性，进一步降低聚合物的毒性。

最近几年，产生了一种新的聚合物合成方法，即Huisgen环加成反应或“Click”反应。Click反应就是将末端带有炔基和叠氮基团的单体通过高选择性环合耦联后形成带有三唑环结构的聚合物，其最早是由Sharpless于2001年提出的。此后，Click反应就被广泛用于合成各种材料。有大量研究表明，杂环和酰胺毗邻的结构能与核酸特异性地稳定结合在一起。因此，利用三唑和酰胺键毗邻的结构可特异性结合DNA以及二硫键的还原响应性，通过合理的结构设计，通过Click反应可合成出既带有三唑和酰胺毗邻的结构又带有二硫键的结构的聚合物，这样，既能提高纳米复合物的胞外稳定性和增强DNA的胞内解离效果，又能增加聚合物降解性、降低聚合物毒性。

发明内容

基于上述研究背景，本发明人以一缩二乙二醇、三乙烯四胺和3，3’-二硫代二丙酸为原料，通过Click反应合成一种具有全新结构的阳离子聚合物。此聚合物含有的仲胺基团带有正电荷，能有效压缩核酸，同时能在酸性条件下接受H+，具有类似PEI的“质子海绵”效应；而且该聚合物中含有醚氧基结构，这就使该聚合物具有一定的亲水性和柔软性，具有类似PEG的性质，能在一定程度上分散聚合物的正电荷，阻止阳离子聚合物/核酸纳米复合物的聚集，减少聚合物对细胞的刺激性；该聚合物中含有的三唑和酰胺键毗邻的结构与DNA有很强的结合能力，可阻止纳米复合物聚集，提高纳米粒在输送过程中的稳定性；并且该聚合物中含有二硫键可提高DNA在胞内的解离效率，提高基因转染效率，此外，二硫键可在胞内降解，大大提高了聚合物的降解性，降低聚合物的毒性。

因此，本发明的目的在于提供一种高效低毒的用作非病毒型基因载体的新型还原响应性阳离子聚合物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供使用该阳离子聚合物制备的阳离子聚合物/核酸纳米复合物及其制备方法和用途。