[发明专利]抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体制备及其应用。

背景技术

近年发现，ATP合成酶不仅存在于线粒体内膜，在内皮细胞和肿瘤细胞质膜表面也有表达。1995年，Mozer和Pizzo对血管抑素(环饼域1-3)在内皮细胞表面的结合位点进行了鉴定。通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)膜组分进行配体杂交，成功分离了与血管抑素结合的，大小约55kD的蛋白。通过对蛋白进行氨基末端测序、肽指纹图谱及免疫学分析表明，抗肿瘤血管新生药血管抑素在该细胞表面的受体为人F1F0-ATP合成酶的α/β亚基(基因名分别为ATP5A1和ATP5B)。这一受体在细胞表面的存在通过流式细胞术和免疫荧光分析得到了证实。另外，血管抑素能与重组ATP5A1结合，抗ATP5A1的抗体能将血管抑素的抗细胞增殖效果抑制掉90％。综上所述，细胞表面的ATP5A1/ATP5B是血管抑素在内皮细胞表面的受体，血管抑素可能通过与ATP5A1/ATP5B亚基的结合，抑制内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制血管新生。

传统认为，人F1F0-ATP合成酶仅存在于细胞线粒体内膜，但Mozer的发现表明其在内皮细胞表面也有定位。在Mozer的研究公开前，关于F1F0-ATP合成酶在细胞膜表面定位的报道仅有一例，是定位于肿瘤细胞系A549的表面。在Mozer的研究公开后，血管抑素与细胞表面ATP合成酶的结合，又被其它的研究团体在不同的肿瘤细胞类型证实。在除内皮细胞外的许多其它类型细胞，包括肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞都发现了定位于细胞膜表面的F1F0-ATP合成酶，这些类型的细胞都具有较强的增殖力，而在红细胞中未发现。这提示F1F0-ATP合成酶也许能作为肿瘤标志物来检测，对肿瘤的早期诊断和预后具有重大的意义。

在Das和Mozer提出哺乳动物细胞存在将某些线粒体蛋白定位于胞膜表面的现象后，涌现出大量有关线粒体基质蛋白定位于胞膜的报道，而这些蛋白在其异常定位上往往也是有某种功能的，如蛋白P32，又名gC1q，是补体蛋白C1q的受体，提示定位于胞膜表面的F1F0-ATP合成酶也在行使某种特殊的功能。在Mozer的研究中，膜表面的F1F0-ATP合成酶作为血管抑素抑制增殖的靶点而被发现，随后发现的具有膜表达人F1F0-ATP合成酶的细胞都属于增殖力较强的类型，提示膜表达的人F1F0-ATP合成酶可能具有促增殖作用，不仅是肿瘤的标志，还可能是癌变的促因。如果能成功验证膜表达的人F1F0-ATP合成酶对肿瘤的促进作用，将使其肿瘤靶标的地位进一步巩固，并可针对其促增殖功能设计相应的药物进行抑制，以期特异高效地治疗肿瘤。

Chi等用纯化的E.coli F1-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株单克隆抗体(mAb)，其中只有一株mAb是针对催化亚基ATP5B的，其余20株均是针对非催化亚基ATP5A1的，而只有针对β亚基的那株mAb具有抑制F1-ATP合成酶活性的作用。而Mozer之前的研究报道，血管抑素在HUVEC表面的受体由ATP5A1和ATP5B共同构成，故本研究着重对ATP5A1亚基的肿瘤相关性进行，并针对ATP5B亚基制备mAb并进行人源化，以期开发相应的抗体药物。

19世纪末，人们用癌细胞免疫动物产生抗血清来治疗癌症。然而，由于抗血清是多克隆抗体，其中含有众多分别针对不同抗原的抗体，缺乏特异性，故用其治疗癌症不可能取得确切的疗效。

20世纪后期，Georges Kohler和Cesar Milstein用细胞杂交技术使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合(图1-1)，建立了世界上首株B细胞杂交瘤细胞株，该细胞株能长期、稳定地分泌特异、均质的抗SRBC的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)。这一技术获得1984年的诺贝尔生理医学奖。mAb对抗原的高特异性使定向攻击肿瘤细胞成为可能。之后的数十年里，mAb在疾病诊断领域成为常规试剂，而在治疗领域对其的研究也迅速升温。

在20世纪末期，由于目前技术的局限，制备的多为鼠杂交瘤，产生的mAb就多为鼠源性，在人体中极易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，使mAb用于治疗的研究受到限制，进入了低谷阶段。