[发明专利]一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针

说明书

技术领域

本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，具体涉及一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针，尤其涉及利用针对呼吸道病毒的特异性核酸探针用液相芯片方式结合多重聚合酶链反应（PCR）技术，用于快速检测多种呼吸道病毒的方法。 

背景技术

呼吸道疾病是世界范围内常见的重要致死疾病之一，引发急性呼吸道感染的病原微生物种类很多，其中病毒占了90%以上，且其引起的临床表现症状都类似：如发热、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、咳嗽、咽痛等。常见的呼吸道病毒包括腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)等。

在对上述病毒检测方面，目前常规应用的检测手段如分离培养方法、免疫学方法以及核酸检测方法如PCR、多重PCR、RT-PCR方法和基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如分离培养方法在技术上比较困难，且获得病原学诊断和药敏结果常需要3～5天以上，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要；而用免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还可能存在抗原抗体间的交叉反应而干扰检测，不利于疾病的早期诊断；在核酸检测方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法及基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但这些方法大多基于单一反应或少数重数的多重反应的检测，在对临床样本进行检测时，对每一个样本的数十种指标进行检测和排除时，需要耗费大量的劳动和成本。

对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。

基于微球的液相芯片技术，提供了一个新的应用面广泛的高通量核酸检测平台。它包含有直径5.6μm的聚苯乙烯微球，其内部染有两种可以进行光谱区分的荧光染料。精确控制两种荧光染料的量，可获得具有特异荧光编码的100种不同微球组。每种微球表面都可以修饰上不同的反应物。因为可以根据微球的特异荧光编码来区分不同的微球组，所以可以将它们混合在一起，在同一个反应容器中同时检测高达100种不同的分析物。在报告分子上还耦合有第三种荧光用于定量分析发生于微球表面的生物分子间的相互作用。微球在高速液流中经由液相芯片分析仪的两个独立激光进行分别检测。一个635nm、10mW的红色二极管激光激发微球上的两种荧光，另一个532nm、13mW的钇铝石榴石（YAG）激光激发结合在微球表面的报告分子的荧光（R-藻红蛋白，Alexa532，或Cy3）。高速数字信号处理器根据荧光编码地址对微球进行分类并定量微球表面的反应。每秒检测数千个微球的能力使该分析系统可以在数秒内对同一反应容器中的每个样品同时分析和报告高达100个不同的反应。

与其它检测方法相比，基于液相芯片技术的检测平台具有以下优点：需标本量少、高通量检测；高速度、低成本；灵敏度高、有重复性好、线性范围广、操作简便等特点。

采用多重PCR联合液相芯片技术，可以快速准确的对呼吸道病毒进行检测。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针。    

本发明利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来检测多种呼吸道病毒，其优势在于，利用该项技术，可以平行一次检测14种呼吸道病毒，包括腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)。并且该技术操作便捷，特异性强，灵敏度高，稳定性好。 

本发明提出的检测多种呼吸道病毒的方法，包括如下步骤：