[发明专利]褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法以及专用培养基

说明书

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及褐飞虱体内类酵母共生菌的离体培养方法以及专用培养基。

背景技术

褐飞虱Nilaparvata lugens St?l是我国及东南亚国家水稻生产上的一种重要远距离迁飞性害虫，严重威胁我国水稻的安全生产，在我国每年发生面积约1300-2000万hm²，约占水稻种植面积的50%，年均损失稻谷10-15亿kg。种植抗虫品种和使用化学杀虫剂是控制褐飞虱为害最为经济有效的防治方法，但由于抗虫品种的大面积种植以及化学杀虫剂的大量使用，导致田间褐飞虱新致害性的出现和抗药性的产生。研究表明，同翅目昆虫，如飞虱、蚜虫、叶蝉等体内普遍存在共生菌，这些共生菌与寄主昆虫互惠互利、协同进化，在昆虫的生长发育、繁殖过程中起着十分重要的作用。褐飞虱共生菌是一种类酵母菌（yeast-like symbiotes，简称YLS），隶属于子囊菌亚门核菌纲的假丝酵母属（Candida），通常存在于腹部脂肪体内，呈长梭形、杆状、卵形和球状，营芽孢生殖，并以卵母细胞垂直传递的方式直接传给子代。这些共生菌在褐飞虱致害性变异、胚胎腹节分化、体内甾醇类物质代谢、氨基酸和维生素合成与供给、氮素循环和蛋白质合成等过程中起重要的作用。褐飞虱体内共生菌种群存在多样性和动态变化以及在外界逆境条件下共生菌可以发生遗传变异。取食抗虫品种以及农药、高温、抗生素等方法处理褐飞虱导致体内共生菌数量显著下降。共生菌遗传基因的易变性使其遗传背景容易发生变化或突变。在褐飞虱适应抗虫品种、形成新致害性种群的过程中，共生菌的遗传物质可能已发生了变异。此种变异可能导致褐飞虱对水稻抗性品种致害性发生改变。因此，在褐飞虱致害性变异过程中，类酵母共生菌可能起着比寄主本身更为重要的作用。由于类酵母共生菌属于单细胞生物，在进行基因工程改造时比对宿主昆虫进行操作要方便的多。因而利用基因工程方法转化类酵母共生菌，降低其在宿主营养及生殖方面所起的作用，不仅可以降低褐飞虱的发生率，找出产生褐飞虱致害性的变化位点，而且可以减少植物病毒的传播。建立褐飞虱类酵母共生菌离体培养技术为转化类酵母共生菌遗传学背景，使其在与抗虫水稻品种的互作中，遗传学背景不易发生变化，为延长抗虫水稻品种的田间使用寿命等试验的进一步开展奠定了基础。由于类酵母共生菌和宿主褐飞虱相互融合，采用分离宿主脂肪体细胞进行培养的方法很难排除来自虫体内环境的污染，昆虫体内类酵母共生菌的离体培养在褐飞虱（Socho等，1981）和烟草窃蠹（Noda等，1996）上虽有报道，但两者均采用虫体进行培养的方法，易造成污染，也未提及具体的培养基配方，且不能获得体外继代培养共生菌的目的。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种褐飞虱类酵母共生菌的离体培养方法及其专用培养基的技术方案，该发明能够获得褐飞虱体外继代培养的类酵母共生菌菌株，为研究褐飞虱适应抗虫品种过程中类酵母共生菌的遗传学背景以及改造共生菌控制褐飞虱的为害提供基础。

所述的培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基，其特征在于包括以下重量配比的组份：

L－天冬氨酸 10－50mg/L、L－精氨酸－氢氧化物10－100mg/L、L－天冬酰氨酸10－50 mg/L、L－丙氨酸10－50 mg/L、B－丙氨酸10－50 mg/L、L－胱氨酸－氢氧化物1－5 mg/L、L－谷氨酸10－100 mg/L、L-谷酰氨酸10－100 mg/L、L－氨基乙酸10－100 mg/L、L－组氨酸100－500 mg/L、L－异亮氨酸1－10 mg/L、L－亮氨酸1－10 mg/L、L－赖氨酸－氢氧化物50－100 mg/L、L－甲硫氨酸1－10 mg/L、L－脯氨酸10－50 mg/L、L－苯丙氨酸10－50 mg/L、DL－丝氨酸50－150 mg/L、L－酪氨酸1－10 mg/L、L－色氨酸5－50 mg/L、L－苏氨酸10－50 mg/L、L－缬氨酸5－50 mg/L、葡萄糖10－100 mg/L、链霉素硫酸盐5－50 mg/L、苹果酸50－100 mg/L、α－酮戊二酸10－50 mg/L、琥珀酸1－10 mg/L、反丁烯二酸1－10 mg/L、核黄素0.001－1 mg/L、泛酸钙0.001－1mg/L、叶酸0.001－1mg/L和烟酸0.001－1mg/L。

所述的培养褐飞虱体内类酵母共生菌的专用培养基，其特征在于包括以下重量配比的组份：