[发明专利]具有改变的净电荷、在去污剂中使用的多点置换的蛋白酶变体

说明书

相关申请 

本申请是1998年10月23日提交的美国专利申请08/956,323、1998年10月23日提交的美国专利申请08/956,564和1998年10月23日提交的美国专利申请08/956,324的部分继续申请，所有这些申请在此都完整引用。 

发明背景 

丝氨酸蛋白酶是羰基水解酶的一个亚组。其包括多种类别的具有广泛特性和生物功能的酶。Stroud，R.，科学美国人(Sci.Amer.)131：74-88。尽管其功能的多样性，但丝氨酸蛋白酶的催化机制至少由两种遗传分离的酶家族来完成：1)枯草杆菌蛋白酶和2)哺乳动物胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶及同源细菌丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶和灰色链霉菌(S.gresius)胰蛋白酶)。这两个丝氨酸蛋白酶家族显示非常相似的催化机理。Kraut，J.(1977)，生物化学年述(Annu.Rev.Biochem.)，46：331-358。此外，尽管一级结构不相关，但这两个酶家族的三级结构存在由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的氨基酸保守催化三联体。 

枯草杆菌蛋白酶是由多种芽孢杆菌属的种及其它微生物大量分泌的丝氨酸蛋白酶(分子量约为27,500)。已经测定了芽孢杆菌属至少九个不同种的枯草杆菌蛋白酶的蛋白质序列。Markland，F.S.等人(1983)，Hooppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.，364：1537-1540。曾经报道了来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)几种天然变体的枯草杆菌蛋白酶的三维晶体结构。这些研究表明，尽管枯草杆菌蛋白酶与哺乳动物丝氨酸蛋白酶在遗传上是不相关的，但它具有相似的活性部位结构。含有共价结合的肽抑制剂的枯草杆菌蛋白酶(Robertus，J.D.等人(1972)， 生物化学(Biochemistry)，11：239-2449)或产物复合物(Robertus，J.D.等人(1976)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，251：1097-1103)的x-射线晶体结构也提供了关于枯草杆菌蛋白酶的活性部位和推断的底物结合裂隙的信息。另外，曾经报道了关于枯草杆菌蛋白酶的大量动力学和化学修饰研究(Svendsen，B.(1976)，Carlsberg研究通讯(Carlsberg Res.Commun.)，41：237-291；Markland，F.S.，同前)，并且至少有一条报道，其中枯草杆菌蛋白酶残基222的甲硫氨酸的侧链被过氧化氢转化为甲硫氨酸-亚砜(Stauffer，D.C.等人(1965)，生物化学杂志，244：5333-5338)，并进行了广泛的位点专一诱变(Wells和Estell(1988)TIBS 13：291-297)。 

在用于去污剂制剂的蛋白酶变体的开发中，一个常见的问题是洗涤条件的多样性，包括可在其中使用蛋白酶变体的不同去污剂制剂。例如，在不同领域中使用的去污剂配方在洗涤用水(wash water)中含有不同浓度的有关成分。例如，欧洲去污剂体系一般在洗涤用水中含有大约4500-5000ppm的去污剂成分，而日本去污剂体系一般在洗涤用水中含有大约667ppm的去污剂成分。在北美洲，尤其在美国，去污剂体系一般在洗涤用水中含有约975ppm的去污剂成分。令人惊奇地，发展了一种可用于低去污剂浓度体系、高去污剂浓度体系和/或中去污剂浓度体系以及可用于所有这三种去污剂浓度体系的蛋白酶变体的合理设计方法。 

发明概述 

本发明的一个目的在于提供在一个或多个残基位置处含有氨基酸置换的蛋白酶变体，该置换改变了该位置的电荷，使其电荷与前体蛋白酶相比负电性更强或正电性更弱，因此该蛋白酶变体在低去污剂浓度体系中比前体蛋白酶更有效。一种低去污剂浓度体系是在洗涤用水中存在少于约800ppm的去污剂成分的洗涤体系。 

本发明的另一个目的在于提供在一个或多个残基位置处含有氨基酸置换的蛋白酶变体，该置换改变了该位置的电荷，使其电荷与前体蛋白酶相比正电性更强或负电性更弱，因此该蛋白酶变体在高去污剂浓度体系 中比前体蛋白酶更有效。一种高去污剂浓度体系是在洗涤用水中存在超过约2000ppm的去污剂成分的洗涤体系。